腐殖質AQS存在條件下腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的特性

謝水波 ，張亞萍，劉金香，劉迎九，李仕友，王勁松，劉海燕

(1.南華大學 城市建設學院，衡陽 421001；2.南華大學 鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室，衡陽 421001)

我國鈾礦冶普遍采用溶浸采礦工藝，產生了大量的尾礦砂和尾礦水。鈾礦冶廢水中常存在大量的235U、238Pu等放射性核素，Cr、Mn、Fe以及取代苯、氯化烴類天然有機物等[1-3]，同時存在大量細菌等微生物。環境中的鈾以難溶性的U(Ⅳ)和水溶性的U(Ⅵ)為主，U(Ⅵ)多以鈾酰離子(UO22+)的形式在環境中遷移。在尾礦庫微環境中，殘余的 U(Ⅵ)、有機物、尾礦微生物等通過溶解、轉化水動力作用等遷移，構成持久性、潛在的放射性污染和重金屬毒害[4]。溶浸采礦理論的發展使鈾的化學釋放原理比較清晰，但微生物對鈾的直接或間接影響比較復雜，許多問題尚不清楚。

在自然界中，腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens,S.putrefaciens)廣泛分布，常見于鈾尾礦地區有機質含量豐富的沉積底泥環境與地下厭氧環境中。LOVLEY等[5]發現了微生物呼吸的新模式—腐殖質呼吸，即呼吸鏈上的電子傳遞過程：在厭氧條件下，腐殖質還原菌通過氧化電子供體，偶聯腐殖質或腐殖質模型物還原，從電子傳遞過程中貯存生命活動需要的能量。在厭氧環境中，腐敗希瓦氏菌利用腐殖質作為電子穿梭體，使可還原態物質還原，如Fe(Ⅲ)[6-10]、Mn(Ⅳ)[9]、Cr(Ⅵ)[11]等重金屬、硝酸鹽[8]、有機污染物[8,10,12-15]等，且能促進U(Ⅵ)的生物還原[11-12,16]。上述發現對進一步研究鈾礦冶中微生物對鈾浸出的阻滯機理及含鈾廢水的生物處理具有重要意義。現有報道中，關于腐敗希瓦氏菌降解偶氮類[10,14-16]有機物的較多，對其與U(Ⅵ)等放射性金屬的作用機理報道較少。

本文作者以腐敗希瓦氏菌為研究對象，探討重金屬及有毒有機物對其還原 U(VI)的影響，以及還原U(VI)的因素與機理，為揭示微生物對鈾浸出的阻滯機理及鈾礦冶廢水的生物處理提供技術支持。

1 實驗

1.1 材料

腐敗希瓦氏菌：購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，CICC編號為22940。

培養基：NH4Cl 0.3 g/L，NaHCO32.5 g/L，MgSO40.025 g/L，MgCl2·6H2O 0.4 g/L，KH2PO4· 7H2O 0.02 g/L，酵母抽提物0.01 g/L(提供少量維生素和微量無機鹽)。

主要試劑：腐殖質模式物蒽醌-2-磺酸鈉(Anthraquinone-2-sulfonate，AQS)，分析純，購自 Sigma公司；U3O8(分析純)，標準鈾溶液采用 GBW04201方法配制；其他試劑均為分析純。

儀器設備：T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司生產)。

1.2 菌株的厭氧培養

實驗裝置如圖1所示。在厭氧培養反應器中，用丁基橡膠塞密封培養瓶口，高純氮氣和二氧化碳混合氣(V(N)2:V(CO)2=4:1)經過裝有細菌過濾器的進氣橡膠管充入到培養瓶中，此時出氣管打開，充氣時間≥15 min。充氣完畢后，用夾子封住所有橡膠管，使瓶口的剩余空間充滿混合氣體。水封，快速將其密封，于 30 ℃在生化培養箱中靜置培養。每次取樣后，重新通氣，以確保厭氧環境。

圖1 厭氧培養裝置Fig.1 Anaerobic culture device

1.3 U()Ⅵ的測定

樣液預處理：用注射器從取樣管抽取適量體積菌體樣液，用細菌過濾器過濾，去除樣液中懸浮菌體。

U(Ⅵ)的測定：采用國家標準GB6768-86分光光度法測定微量鈾。

1.4 腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ實驗

向 500 mL錐形瓶中分別加入上述培養液 400 mL、5 mmol/L乙酸鈉和1 mmol/L AQS；用NaOH和HCI調節pH值，控制懸浮菌液OD600≈0.700 (約2.3 g/L，OD600指細菌懸浮液在600 nm波長處的吸光值)，接種定量菌液到培養液中。

按1.2節操作后，定時取樣分析，測定培養液中剩余U(Ⅵ)濃度。

U(Ⅵ)初始濃度影響實驗：U(Ⅵ)的初始濃度為10～80 mg/L，設有濃度梯度。

她望著火苗，氣得直跺腳，一邊打自己的耳光，一邊咒罵自己：“我真該死，我真該死哇，我為什么不清理灶門……”

菌體投加量影響實驗：以懸浮菌液量表示，在0.50～10.0 mL的范圍內，設置體積梯度。

AQS用量影響實驗： AQS濃度為0～10 mmol/L，設置濃度梯度。

電子供體影響實驗：以5 mmol/L的甲酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉為外加電子供體，以無外加電子供體作空白。

在單因素實驗中，研究確定 pH值對腐敗希瓦氏菌腐殖質還原 U(Ⅵ)的影響，結果表明，pH 值約為7.0時，U(Ⅵ)還原效率較高。因此，在本研究中，主要實驗均在初始pH值約為7.0條件下完成。

1.5 有毒物質對腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

有毒有機物對 U(Ⅵ)還原的影響：分別以 5 mmol/L甲苯、三氯乙酸和對硝基苯酚 3種有毒有機物作為電子供體，無外加電子供體作為空白，進行實驗。

金屬離子對 U(Ⅵ)還原的影響：分別加入一定濃度的Mn2+、Cr6+、Cu2+和Ca2+，以無外加金屬離子培養液作為對照，進行實驗。

其他實驗操作同1.2節。

2 結果與分析

2.1 U()Ⅵ初始濃度對腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

目標菌株對U(Ⅵ)耐受性實驗結果表明：當U(Ⅵ)的濃度為20 mg/L時，菌株的耐受性較好；當濃度為50 mg/L時，其生長受到較大抑制。當U(Ⅵ)初始濃度為50 mg/L時，仍具有一定的還原效果，這是因為培養基中微量的H2PO4-與U(Ⅵ)結合，起緩沖作用，降低了 U(Ⅵ)對菌體的生物毒性。當 U(Ⅵ)初始濃度為10 mg/L時，24 h內U(Ⅵ)的還原效率緩慢增加，推斷該過程是磷酸鈾酰分子緩慢被腐殖質還原的過程。LING 和SZYMANOWSKT[17]報道，在培養液中加入一定量EDTA后，吸附在菌體表面的U(Ⅵ)濃度升高，促進了U(Ⅵ)的還原。這也可以用來解釋微量H2PO4-對U(Ⅵ)還原的促進作用。

當U(Ⅵ)的初始濃度為30 mg/L時，在24 h內，U(Ⅵ)的還原效率可達96%，具有較高的還原效率，以下實驗均在此初始濃度條件下進行。

圖2 U(Ⅵ)初始濃度對U(Ⅵ)還原的影響Fig.2 Effect of initial concentration of U(Ⅵ)on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

2.2 菌體投加量對腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

圖3 菌體投加量對U(Ⅵ)的還原影響Fig.3 Effect of bacteria volume on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖3所示為菌體投加量的實驗結果。結果表明，在前10 h，U(Ⅵ)的還原效率隨菌體投加量的增加均顯著增大。當菌體投加量為2 mL時，U(Ⅵ)的還原效率達到最高，超過閾值，U(Ⅵ)還原效率隨著菌體濃度的增加而略有降低。分 析認為，在腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的過程中，需要一定的營養物質、電子供體、AQS等，在適當的環境(配比)下，將出現較高還原效率。在最初階段中，隨著菌體量的增加，菌株間對營養物質的競爭作用增加，使得U(Ⅵ)的還原效率略有下降。24 h后，菌體投加量對U(Ⅵ)的還原效率的影響不大。

2.3 AQS用量對腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

AQS對腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的實驗結果如 4和5所示。結果表明，不同濃度的AQS對腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響存在差異。

圖4 AQS濃度對U(Ⅵ)還原的影響Fig.4 Effect of AQS concentration on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖5 12 h時AQS濃度對U(Ⅵ)的還原效率的影響Fig.5 Effect of AQS concentration on reduction of U(Ⅵ)in 12 h by S.putrefaciens

當AQS濃度在0～2 mmol/L范圍時，能顯著加速U(Ⅵ)的還原；當 AQS濃度為2 mmol/L時，在12 h內，可將溶液中U(Ⅵ)濃度從30 mg/L降至1.91 mg/L，U(Ⅵ)還原效率達90%以上；當其濃度高于2 mmol/L時，隨著AQS濃度的增加，U(Ⅵ)還原效率下降，AQS對 U(Ⅵ)還原存在較強的抑制作用。這一結果表明，腐殖質的確可作為氧化還原中間體穿梭于電子供體與U(Ⅵ)之間，促進U(Ⅵ)的還原。但當其濃度達到某一閾值時，它與U(Ⅵ)存在電子競爭，使U(Ⅵ)還原效率反而下降。其原因在于其氧化還原電勢存在差異，細菌呼吸鏈的電子載體對AQS和U(Ⅵ)的親和力不同，使AQS濃度對U(Ⅵ)還原產生影響。

2.4 電子供體對腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

外加電子供體對腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響如圖6所示。由圖6可知，外加電子供體是影響腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的另一個重要因素。在12 h內，加入甲酸鈉、乙酸鈉和乳酸鈉等外加電子供體的培養液，U(Ⅵ)的還原效率均在80%以上，與無外加電子供體的培養液相比，U(Ⅵ)的還原效率更高。外加電子供體不同，U(Ⅵ)的還原效率也略有差異。其原因如下：乳酸鈉、甲酸鈉和乙酸鈉的氧化還原電勢不同，如φΘ(乙酸鈉)= -120 mV，φΘ(甲酸鈉)=-430 mV[10]，甲酸鈉的失電子能力較乙酸鈉的更強，細菌對甲酸鈉的利用效率更高，因此，含甲酸鈉的培養液中 U(Ⅵ)的還原效率也更高。在無外加電子供體培養液中也觀測到一定的 U(Ⅵ)被還原，可能是溶液中存在的微量酵母菌膏充當了電子供體。

圖6 電子供體對腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響Fig.6 Effect of electron donors on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

3 環境有毒物質對腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響

3.1 有毒有機物對腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的影響

在本實驗中，分別以甲苯、三氯乙酸和對硝基苯酚為電子供體，考察其對腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的影響，實驗結果如圖7所示。從圖7可以看出，3種物質均可以作為電子供體支持 U(Ⅵ)的高效還原。在12 h內，菌體利用甲苯、三氯乙酸和對硝基苯酚腐殖質還原 U(Ⅵ)的效率分別達到 76.80%、94.89%和96.59%。與未加電子供體的培養液相比，顯著地促進了U(Ⅵ)的還原。

圖7 有毒有機物對U(Ⅵ)還原的影響Fig.7 Effect of toxic organic compounds on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖8所示為有毒有機物作為電子供體促進 U(Ⅵ)還原的原理圖。腐敗希瓦氏菌通過酶促反應氧化甲苯等有機物，AQS作為氧化還原中間體接受來自甲苯等提供的電子，其自身被還原，生成羥醌。還原態的AQS再將電子傳遞給U(Ⅵ)，完成還原過程。隨著AQS 氧化態與還原態形式的循環轉換，對 U(Ⅵ)還原起明顯的促進作用。同時, 甲苯失去電子被氧化降解為CO2[10]。許志誠等[15]在利用希瓦氏菌還原偶氮染料的實驗中也有類似報道，推測存在更多有毒有機物質可以作為電子供體支持腐敗希瓦氏菌腐殖質還原U(Ⅵ)，但有待進一步的實驗證明。這一工作對修復鈾尾礦庫區域的復合型污染具有一定的實用價值，對有毒有機物的降解具有重要的環境學意義。

圖8 有毒有機物作為電子供體促進U(Ⅵ)還原的原理圖Fig.8 Mechanism of AQS mediated reduction of U(Ⅵ)with exogenous carbon as electron donors

3.2 金屬離子對腐敗希瓦氏菌還原U()Ⅵ的影響

考察 Cu2+、Ca2+、Cr6+和 Mn2+對 U(Ⅵ)還原的影響，且研究菌株對各種離子的耐受性。結果表明，濃度為2.0 mmol/L的Cr6+、Cu2+和Mn2+均在菌株的耐受范圍內。圖9～11所示為金屬離子作用下腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的結果。結果表明，在 4種金屬離子中，Ca2+和 Cu2+對 U(Ⅵ)的還原影響顯著。與無外加金屬離子相比，60 h內，2 mmol/L Ca2+使U(Ⅵ)的還原效率由97%降至42%。這可能是因為在水溶液中，Ca2+與U(Ⅵ)生成鈣鈾碳酸鹽絡合物，使U(Ⅵ)的活性鍵被占用。鈣鈾碳酸鹽絡合物穩定性較高，在 U(Ⅵ)接受電子時，U(Ⅵ)的活性鍵不易重新釋放，從而降低了U(Ⅵ)的氧化還原活性，影響了U(Ⅵ)的生物還原[17-18]。

圖9 重金屬離子對U(Ⅵ)還原的影響Fig.9 Effect of heavy metal ions on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖10 Cr6+濃度對U(Ⅵ)還原的影響Fig.10 Effect of Cr6+ concentration on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

圖11 Cu2+濃度對U(Ⅵ)還原的影響Fig.11 Effect of Cu2+ concentration on U(Ⅵ)reduction by S.putrefaciens

從圖9和10可以看出，Mn2+和Cr6+對腐殖質還原U(Ⅵ)的影響較小。在60 h內，與沒有外加重金屬離子的實驗樣液對照，添加 1.0 mmol/L Cr6+、2.0 mmol/L Cr6+、2.0 mmol/L Mn2+于培養液中，U(Ⅵ)的還原效率分別降低了 1.85%、4.38%和 9.31%左右。VERRAMANI等[19]發現 Mn2+對微生物還原 U(VI)的成礦作用和反應生成的瀝青鈾礦結構均有一定影響。本研究采用二苯碳酰二肼法測定了培養液中Cr6+的濃度，未觀察到Cr6+濃度的明顯變化。這是因為在中性環境中，φΘ(Mn(Ⅱ)/Mn(s))=-1 029 mV、φΘ(Cr(Ⅵ)/Cr(Ⅲ))=-130 mV[11]，而φΘ(U(Ⅵ)/U(Ⅳ))= +273 mV，Cr(Ⅵ)和 Mn(Ⅱ)的得電子能力遠弱于 U(Ⅵ)的得電子能力。因此，在電子傳遞過程中，Cr6+和Mn2+對U(Ⅵ)還原影響較小。GU和 CHEN[11]研究結果表明，在pH=3的酸性環境中，Cr6+被AQS化學還原；但在中性環境中，Cr6+生物還原作用不明顯，還原過程緩慢[20]，與本研究結果基本一致。當環境變化時，Cr6+、Mn2+及 U(Ⅵ)的氧化還原電位也發生變化，可能會得到不同的實驗結果。

當 Cu2+存在時，腐敗希瓦氏菌對 U(Ⅵ)的還原結果如圖11所示。從圖11可以看出，Cu2+對U(Ⅵ)的還原具有強烈的抑制作用。當Cu2+濃度為2 mmol/L時，在60 h內，U(Ⅵ)的還原效率僅為12.7%。本課題組也研究了 Cu2+對硫酸鹽還原菌(SRB)還原 U(Ⅵ)的影響[18,21]，實驗結果證明，Cu2+與呼吸鏈始端脫氫酶的FeS蛋白的活性中心相結合，破壞了蛋白的活性中心，從而使該蛋白質失去氧化電子供體的能力，降低了U(Ⅵ)的生物還原效率[22]。本研究更進一步證明了腐敗希瓦氏菌腐殖質還原U(Ⅵ)的過程與電子傳遞鏈密切相關。

4 結論

1)在濃度為0～2 mmol/L范圍內，AQS能顯著加速菌體對U(Ⅵ)的還原。當AQS濃度為2 mmol/L 時，U(Ⅵ)的還原效率達到最大值，在12 h內，U(Ⅵ)還原效率可達90%以上；當AQS濃度高于2 mmol/L的濃度閾值時，隨著AQS濃度的增加，U(Ⅵ)的還原效率逐步降低。

2)在厭氧條件下，腐敗希瓦氏菌能利用多種有機酸鹽作為電子供體，以AQS作為電子穿梭載體，高效還原U(Ⅵ)。當分別以5 mmol/L的甲酸鈉、乙酸鈉和乳酸鈉作為腐敗希瓦氏菌的外加電子供體時, U(VI)的還原效率由高到低的順序為乳酸鈉、甲酸鈉、乙酸鈉。

3)甲苯、三氯乙酸和對硝基苯酚3種物質均可以作為腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的電子供體，且具有較高U(Ⅵ)還原效率。腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)的同時，可將甲苯、三氯乙酸和對硝基苯酚氧化降解。

4)環境有毒物質對腐敗希瓦氏還原U(Ⅵ)的影響較大。Cr6+、Mn2+、Cu2+和Ca2+4種金屬離子對腐敗希瓦氏菌還原 U(Ⅵ)的影響存在較大差異。Cu2+和 Ca2+對腐敗希瓦氏菌還原U(Ⅵ)存在較強的抑制作用；Cr6+和 Mn2+對還原 U(Ⅵ)的影響相對較小。金屬離子對U(Ⅵ)還原的影響強弱與其離子濃度正相關。

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