針刺對哮喘大鼠肺與大腸SP-A mRNA表達的影響*

嚴興科，張 燕，于 璐，陳 程，崔海福，楊 波

(1．甘肅中醫學院針灸推拿系，甘肅 蘭州 730000;2．長春中醫藥大學針灸推拿學院，吉林長春 130117)

肺與大腸表里相合，是中醫臟腑表里相關理論的組成部分之一。肺與大腸在生理上相互聯系，病理上相互影響。有資料［1］表明，二者的密切聯系具有生物醫學依據。以往認為肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)只在肺內存在［2］，且有 A、B、C、D 4種亞型，其中以SP-A含量最為豐富，是降低肺泡表面張力，維持肺泡穩定和正常的呼吸功能的重要物質。近來發現，在結腸和小腸表面也有SP-A基因存在和蛋白表達［3］，表明腸道表面和肺表面存在密切聯系。本實驗從針灸治療哮喘為切入點，觀察了哮喘大鼠肺與大腸SP-A mRNA表達改變及針刺對其的調節，為臟腑相關的物質基礎研究和針灸效應研究提供依據。

1 材料與動物

1．1 動 物

雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級，體質量(130±30)g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號為20080020。

1．2 試劑與儀器

卵蛋白，OVA，美國Sigma公司進口分裝，批號20080321;氫氧化鋁，長春新華宇生物科技有限公司，批號20080626;戊巴比妥鈉，美國Sigma公司進口分裝，批號200901111;TRIzol，美國 Invitrogen公司產品;氯仿，北京市化工廠產品，批號20090121;DEPC原液，Sigma公司進口分裝;瓊脂糖，西班牙Biowest公司產品;RT-PCR一步法試劑盒，美國Promega公司產品;DNA Marker，北京天根生化科技有限公司產品;引物序列，寶生物工程大連有限公司產品。SMUP-B型生物信號處理系統，上海嘉龍教學儀器廠產品;呼吸流量測定系統，美國Kent Scientific Corporation產品;呼吸流量實驗測量軟件，復旦大學醫學院生理教研室提供;Allegra X-22R低溫高速離心機，德國Beckman Coulter公司產品;5418小型高速離心機，Eppendorf公司產品;TC-512 PCR擴增儀，英國Techne公司產品;Cintra 202型紫外分光光度計，澳大利亞GBC公司產品;DYY-12C型水平電泳系統，北京六一儀器廠產品;Power Pac HV電泳儀，美國Bio-Rad公司產品;TANNON-2010數碼凝膠圖像分析系統及GIS凝膠圖像分析軟件，上海天能科技有限公司產品;Milli-DI超純水系統，美國Millipore公司產品。

1．3 分組與模型的建立

將48只SD大鼠隨機分成空白對照組、捆綁組、假手術組、哮喘模型組、原絡配穴組(太淵、偏歷)、原穴組(太淵)6組。

哮喘模型組的處理參照文獻方法［4］：將SD大鼠在實驗第1天一次性向腹腔注射含卵蛋白0．250 g和氫氧化鋁凝膠0．250 g的生理鹽水1．5 mL以致敏，第15天將大鼠用5 g/L戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術臺上，行氣管插管術，并于頸外靜脈內注射卵蛋白(0．250 g/kg體質量)激發哮喘發作。原絡配穴組大鼠、原穴組大鼠第1天致敏，腹腔注射后1 h進行針刺治療，于實驗第15天激發哮喘發作，方法同上。假手術組大鼠于第1天腹腔注射1．5 mL生理鹽水，第15天以等量生理鹽水(1 μL/g)行頸外靜脈注射，方法同上。空白對照組大鼠不做任何處理，正常飼養。

1．4 穴位選取與針刺

穴位定位據《實驗針灸學》［5］確定。針刺方法：平補平瀉，每次留針20 min，每隔5 min行針1次，隔日針刺1次，共針7次。

原絡配穴組自實驗第1天開始進行針刺治療，穴位選取太淵(雙)、偏歷(雙);原穴組穴位選取太淵(雙);捆綁組自實驗第1天起開始捆綁，不針刺，每次20 min，隔日綁1次，共捆綁7次。

1．5 檢測指標與方法

1．5．1 各組大鼠總RNA樣品的制備

大鼠放血處死后，迅速在冰盤上切取肺、大腸組織。組織選取部位：肺組織——取左肺下葉肺尖(1 cm×1 cm);大腸組織——自闌門向大腸方向2．5 cm處取1 cm腸段。組織切取后用錫紙包好，迅速做好標記放入液氮中冷凍，使液氮滲透到組織內部而防止組織內部發生RNA降解，后移至-80℃超低溫冰箱中保存。

用TRIzol法抽提組織中的總RNA，所得總RNA經紫外分管光度計檢測純度及濃度。用紫外分光光度計檢測波長260 nm和280 nm的吸光度值，D260/D280的比值在1．8～2．0之間的予以保留，其余棄去不用。總 RNA原液稀釋一定比例，使樣品總RNA溶液的D260值在0．1～0．4之間，放入通光池中檢測，利用公式計算總RNA的濃度。根據所測RNA濃度調整PCR體系中總RNA的體積，使各體系所含的RNA量相同。

1．5．2 肺與大腸SP-A mRNA表達水平

引物序列設計按照參考文獻［6］，引物序列由寶生物工程(大連)公司合成。SP-A：5’-GGAAGCCCTGGGATCCCTGGA-3’(上游)，5’-TGGGTACCAGTTGGTGTAGT-3’(下游);GAPDH：5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG3’(上游)，5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’(下游)。以SP-A為目的基因，以GAPDH為內參，在同一體系內做RT-PCR基因擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳，將同一泳道內的SP-A與GAPDH兩條基因表達條帶的相對密度比作為SP-A mRNA表達水平的反映。

一步法RT-PCR反應程序：45℃逆轉錄45 min，94℃預變性 2 min，94℃變性 30 s，60℃退火1 min，延伸 68℃ 2 min，循環 40次，68℃延伸7 min，最后降至4℃結束反應。基因擴增結束后，取3 mL RT-PCR產物在經EB染色的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓60 V，時間為100 min。

各組RNA樣品按一步法程序經RT-PCR基因擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束將凝膠移至GIS數碼凝膠圖像分析系統中拍照。

1．6 統計學方法

采用SPSS 11．0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數()±標準差(s)表示，多組間比較和組間兩兩比較用單因素方差分析。以P＜0．05為差別有統計學意義。

2 結果

肺和大腸組織中均有SP-A mRNA表達。各組中肺和大腸SP-A mRNA的表達水平由SP-A和GAPDH 2條條帶的相對密度比代表。見圖1及表1，2。

圖1 各組大鼠肺與大腸組織SP-A mRNA表達

表1 肺組織中SP-A mRNA表達水平 ±s

表1 肺組織中SP-A mRNA表達水平 ±s

注：與空白對照組對比，＊＊P ＜0．05;與假手術組對比，###P ＜0．01;與哮喘模型組對比，△△ P＜0．05，△△△P＜0．01;與原穴組對比，＊＊P ＜0．05。

組 別 動物數 SP-A，GAPDH 相對密度比空白對照組81．204 ±0．028捆綁組 8 1．458 ±0．095＊＊假手術組 8 1．538 ±0．202＊＊哮喘模型組 8 0．920 ±0．092###原絡配穴組 8 1．215 ±0．211△△△＊＊原穴組 8 1．102 ±0．199△△

表2 大腸組織中SP-A mRNA表達水平 ±s

表2 大腸組織中SP-A mRNA表達水平 ±s

注：與空白對照組對比，＊＊P＜0．05;與假手術組對比，##P＜0．05;與哮喘模型組比較，△△P＜0．05;與原穴組對比，＊P＞0．05。

組 別 動物數 SP-A，GAPDH 相對密度比空白對照組81．592 ±0．082捆綁組 8 1．760 ±0．056＊＊#假手術組 8 1．210 ±0．103＊＊哮喘模型組 8 0．872 ±0．060##原絡配穴組 8 1．071 ±0．062△△＊原穴組 8 1．233 ±0．047△△

圖1可見，肺和大腸組織中均擴增出目的基因SP-A和內參GAPDH基因，且各組間SP-A基因的表達豐度存在差異。由表1可知，哮喘模型組大鼠肺組織SP-A mRNA表達水平與假手術組對比明顯降低，差別有統計學意義(P＜0．01);捆綁組、假手術組與空白對照組對比，肺組織SP-A mRNA的表達水平升高，差別有統計學意義(P＜0．05)，提示捆綁束縛刺激、手術傷害性損傷等因素對大鼠肺SP-A mRNA表達有顯著影響;原絡配穴組和原穴組大鼠肺組織SPA mRN表達水平與哮喘模型組對比明顯升高，差別有統計學意義(P ＜0．01，P ＜0．05)，且原絡配穴組大鼠肺組織SP-A mRNA表達水平高于原穴組，差別有統計學意義(P＜0．05)。提示針刺能夠明顯升高哮喘大鼠肺組織中SP-A mRNA表達水平，原絡配穴法效果優于單純原穴法治療。

由表2可知，捆綁組、假手術組大腸組織SP-A mRNA表達水平與空白對照組對比，假手術組與捆綁組對比，差別均有統計學意義(P＜0．05)，提示手術傷害性損傷對大鼠大腸SP-A mRNA表達有明顯影響，手術傷害性損傷與捆綁是2種不同性質的刺激;原絡配穴組、原穴組大鼠大腸組織SP-A mRNA表達水平與哮喘模型組對比，差別均有統計學意義(P＜0．05)，而此2組間差別無統計學意義(P＞0．05)，但以原絡配穴組升高幅度較大，提示針刺治療能夠顯著升高哮喘大鼠大腸組織SP-A mRNA的表達水平，且以原絡配穴法效果較優。

3 討論

整體觀念是中醫學的基本特征之一，臟腑相關是其理論核心，認為人體內部的組織器官是相互聯系的統一整體［7］，并在中醫臨床實踐中發揮著至關重要的指導作用。中醫學關于肺和大腸關系的認識源于《黃帝內經》，《靈樞·本輸》篇稱這種關系為“肺合大腸”，《素問·血氣形志》篇稱之為“陽明與太陰為表里”。肺與大腸通過經絡相聯系，構成臟腑陰陽表里的絡屬關系，構成肺與大腸在生理、病理、治療上的相互關系。肺與大腸的上述有機聯系，是中醫學以藏象學說為核心的整體觀念的一種體現。

SP-A是肺表面活性物質的重要蛋白成分，在肺泡中的功能是促進PS在氣液界面的吸附和擴展，協助表面活性物質磷脂降低表面張力，調節磷脂的合成、分泌和再循環。SP-A能夠維持PS正常的結構和代謝，表現為SP-A作為自身調節因子可穩定細胞內外的表面活性物質水平［8］。因此，SP-A在肺中的作用之一是保證PS發揮其正常的生理功能，維持正常的呼吸運動。PS量的減少和SP-A、SP-B等的基因改變與呼吸系統疾病密切相關。有學者［9］測定了哮喘患者與正常人肺泡灌洗液中SP-A蛋白的含量，發現哮喘患者肺泡灌洗液中SP-A含量明顯下降(P＜0．05)，而磷脂酰膽堿含量基本一致。

SP-A有調節炎性及過敏反應的作用，在肺的免疫系統防御功能中有重要作用［10］。以往認為，SP-A只在肺內存在，且含量最為豐富，是降低肺泡表面張力、維持肺泡穩定和正常的呼吸功能的重要物質。近來發現，在結腸和小腸表面也發現有SP-A基因和蛋白表達存在［3］，表明腸道表面和肺表面存在密切聯系。

本次研究結果也顯示，哮喘模型組大鼠肺及大腸組織中SP-A mRNA的表達水平低于假手術組大鼠，而針刺相應腧穴又可使肺和大腸組織中SP-A mRNA表達顯著增加，提示SP-A基因和蛋白表達可能是肺和大腸相關的重要物質基礎和途徑。有資料［11］表明，結腸和肺中SP-A基因序列完全相同，且這兩種器官中編碼SP-A的基因轉錄子起始于相同的位點，此為本實驗結果提供了依據。本實驗中，哮喘發作時SP-A mRNA表達減少，針刺后SP-A mRNA表達增加，說明肺與大腸組織SP-A mRNA的表達減少或增加均與哮喘發病有關，SP-A可能是肺和大腸之間相互聯系的物質基礎和途徑。同時實驗結果還顯示針刺提高了哮喘大鼠肺和大腸組織中SP-A mRNA的表達水平，且原絡配穴組針刺效果優于單純原穴針刺組，提示針刺參與調節哮喘大鼠肺和大腸組織SP-A mRNA的表達水平，并且強調了表里兩經的聯系和協同作用，而肺和大腸組織中SP-A存在的聯系機制和具體作用途徑還有待于今后更深入地研究。

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