miR-124對人成骨肉瘤MG-63細胞生長增殖的影響

唐志斌，廖 瑛

（南華大學第一附屬醫院骨外科，湖南 衡陽 421001）

microRNA是近年來發現于真核細胞中的一類內源性非編碼小分子RNA，它在調控基因的轉錄和蛋白翻譯中發揮重要的作用，是近年來生命科學的研究熱點，人類miRNA通過調控其靶基因的表達及相關信號通路，在腫瘤的發生、發展和轉歸過程中發揮重要作用［1］。研究表明，miR-124在宮頸癌和肝癌組織中表達下調，miR-124可通過靶向ITGB1抑制口腔鱗狀細胞癌的生長，也可通過靶向CDK6抑制髓母細胞瘤細胞的生長與浸潤［2-5］。本文采用MTT檢測miR-124對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響，為進一步闡明成骨肉瘤發生發展的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系

MG-63細胞為人成骨肉瘤細胞系，購自北京協和細胞生物所。MG-63細胞培養于含15%小牛血清的MEM培養基（Gibco公司）。

1.1.2 試劑

MTT為Sigma產品；脂質體2000購自Invitrogen公司；miR-124模擬物與抑制劑購自上海吉瑪生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

MG-63細胞常規培養，選擇對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞轉染

1×104細胞于96孔板中，完全培養基中細胞生長至30%匯合期。加入2.5μL的脂質體于100μL無血清培養基中混勻靜置15min，稀釋12.5pmol的miR-124模擬物或抑制劑于50μL無血清培養基中，混合上述脂質體與DNA稀釋液，室溫放置30min；分別用PBS與無血清培養基洗滌細胞；將上述混合物加入96孔板中，然后再加100μL無血清培養基，CO2培養箱中，37°C培養6h；棄上清，加入完全培養基繼續培養過夜。

1.2.3 MTT法測定

設立空白對照組、脂質體組、miR-124模擬物組以及miR-124抑制劑組。每組設立4個重復孔，分別在轉染24h、48h和72h后，每孔加入 MTT溶液（5mg／ml）20μL，繼續孵育4h，終止培養，棄去培養液，每孔加入150μL二甲亞砜，震蕩10min，選擇570nm波長，在酶標儀上測定各孔的吸光度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 miR-124模擬物對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性的影響

人成骨肉瘤MG-63細胞經miR-124模擬物處理后，細胞生長明顯比未處理細胞的生長減緩；處理24h、48h、72h后其吸光值 A值分別為（0.149±0.006）、（0.163±0.007）、（0.212±0.009），分別與對照組（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均顯著下調，具有顯著抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.01），提示miR-124模擬物可抑制人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性。

2.2 miR-124抑制劑對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性的影響

人成骨肉瘤MG-63細胞經miR-124抑制劑處理后，細胞生長明顯比未處理細胞的生長迅速；處理24h、48h、72h后其吸光值 A值分別為（0.313±0.016）、（0.542±0.033）、（0.713±0.041），分別與對照組（0.261±0.017）、（0.379±0.021）、（0.414±0.031）相比，均顯著上調，具有顯著促進作用，差異有統計學意義（P＜0.01），提示miR-124抑制劑可促進人成骨肉瘤MG-63細胞增殖活性。

3 討論

骨肉瘤又稱成骨肉瘤，是惡性骨腫瘤中最常見惡性程度最高的一種，又分為成骨性骨肉瘤及溶骨性骨肉瘤兩類。發病年齡多在15～25歲。70%以上的患者發生在股骨遠端和脛骨近端。惡性腫瘤難以治愈的主要原因就是不容易早期診斷，一旦確診，大多數已經到中晚期，已形成較廣泛的浸潤或轉移，臨床治療效果差。成骨肉瘤肺轉移是目前導致患者治療失敗和死亡的最主要的原因。

miRNA是新近證明的一類長約19～25nt的內源性非編碼的小分子RNA，在多個物種中廣泛存在，包括動物、植物和病毒。目前，被證實的小RNA就有500多種，而計算機預測可能會超過1000個，且約1／3的人類基因被小RNA調控。隨著更多的miRNA被鑒定和深入研究，越來越多的證據表明，miRNA在細胞生長、增殖、發育和凋亡過程中扮演著重要角色，并與多種腫瘤的發生有關。目前，有研究利用針對目的miRNA進行模擬物過表達或者抑制劑干擾miRNA來研究各種miRNA在細胞中的生物學功能［6］。miR-124在多種腫瘤組織和細胞中表達下調［2-5］，本研究顯示miR-124的模擬物及抑制劑分別可抑制和促進人成骨肉瘤MG-63細胞生長增殖活性，提示miR-124可能作為抑瘤基因miRNA參與成骨肉瘤的發生發展。

miRNA可以作為新的分子標志物用于惡性腫瘤的早期診斷和預后預測，將展示出廣闊的臨床應用前景。針對miR-124建立行之有效的檢測手段以及靶向治療策略，為進一步闡明成骨肉瘤發生發展的分子機制，將為成骨肉瘤早期診斷、治療方案選擇、療效評價以及預后判斷提供重要的理論和實驗依據。綜上所述，miR-124有調控骨肉瘤細胞的增殖能力，miRNA是一種天然的反義作用因子，利用miRNA模擬物或抑制劑可能成為基因治療骨肉瘤的一個新的研究方向。但miR-124不是骨肉瘤中唯一異常表達的miRNA，因此應該找出更多異常表達的miRNA分子，發現它們之間的聯系，為更好理解骨肉瘤的發生機制及骨肉瘤的基因治療提供更好的理論支持。

［1］ZHANG L，DENG T，LI X，et al.microRNA-141is involved in a nasopharyngeal carcinoma-related genes network［J］.Carcinogenesis.2010，31（4）：559-66.

［2］FURUTA M，KOZAKI KI，TANAKA S，et al.miR-124and miR-203are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma.Carcinogenesis［J］.2010，31（5）：766-76.

［3］LI KK，PANG JC，CHING AK，et al.miR-124is frequently down-regulated in medulloblastoma and is a negative regulator of SLC16A1［J］.Hum Pathol，2009，40（9）：1234-43.

［4］PIERSON J，HOSTAGER B，FAN R，et al.Regulation of cyclin dependent kinase 6by microRNA 124in medulloblastoma［J］.J Neurooncol，2008，90（1）：1-7.

［5］HUNT S，JONES AV，HINSLEY EE，et al.MicroRNA-124 suppresses oral squamous cell carcinoma motility by targeting ITGB1［J］.FEBS Lett，2011，585（1）：187-92.

［6］吳子晏，劉小云，楊述華，等.miR-21對骨肉瘤細胞增殖的影響［J］.中國癌癥雜志，2010，20（8）：561-564.