馬鈴薯StHb1蛋白的亞細胞定位

李繼剛，鄭建坡，曲占良

（河北大學 生命科學學院，河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北 保定 071002）

馬鈴薯StHb1蛋白的亞細胞定位

李繼剛，鄭建坡，曲占良

（河北大學 生命科學學院，河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北 保定 071002）

為了研究馬鈴薯StHb1蛋白的亞細胞定位情況，采用RT-PCR技術克隆到馬鈴薯StHb1基因cDNA序列，并成功構建了StHb1基因與綠色熒光蛋白基因的融合表達載體pBI121-StHb1-GFP.利用農桿菌介導法將重組載體轉化洋蔥內表皮細胞，通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白的瞬時表達以確定StHb1蛋白在細胞內的分布.結果表明StHb1蛋白主要分布于細胞核中.

非共生血紅蛋白；綠色熒光蛋白（GFP）；亞細胞定位；融合表達載體；農桿菌介導轉化

植物界存在3種類型血紅蛋白：共生型血紅蛋白、非共生型血紅蛋白和截短型血紅蛋白，其中非共生型血紅蛋白（nsHbs）又可細分為nsHb1和nsHb2［1］.馬鈴薯中已發現的非共生血紅蛋白屬于類型1（即StHb1）.研究表明，nsHb1有極高的O2親和力和很低的解離常數，一般在植物體內不承擔O2的運輸和儲存功能.nsHb1為脅迫誘導型蛋白，在組織缺氧或低溫脅迫條件下，NO和H2O2可影響nsHb1的表達［2-5］，且已有報道，nsHb1的表達可能與植物體抗病應答反應相關［6-7］.本實驗室前期分析了馬鈴薯StHb1基因的表達與致病疫霉（Phytophthorainfestans）侵染及植物抗病通路信號分子NO和H2O2之間的相關性，結果顯示，P.infestans及外源NO和H2O2均明顯抑制馬鈴薯感、抗性品種中StHb1基因的表達.

本文在以上研究的基礎上，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作為標記基因［8］，對StHb1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞內的亞細胞定位情況進行了研究，為闡明馬鈴薯StHb1基因的生物學功能及在抗病應答機制中發揮的作用提供新的線索.

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

荷蘭十五（馬鈴薯晚疫病感性栽培品種）購自希森馬鈴薯產業集團有限公司；洋蔥購自本地超市；大腸桿菌DH5α菌株、根癌農桿菌LBA4404菌株由本實驗室保存；載體pBI121-GFP由本實驗室構建及保存；MMLV逆轉錄酶、高保真Taq酶、限制性核酸內切酶及DNA Marker等均購自TaKaRa（大連）公司；TRIquick Reagent購自Solarbio；其他化學試劑均為國產分析純；熒光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS，BX 53）.

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯總RNA的提取

馬鈴薯荷蘭十五塊莖經液氮速凍后研磨，按TRIquick Reagent試劑說明書提取塊莖的總RNA.以紫外分光光度計測A260／A280比值，并以10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的質量.

1.2.2 馬鈴薯StHb1基因的克隆

根據GenBank已收錄的序列號為AY151389.1的核酸序列［9］，通過Primer Premier 5.0軟件設計基因特異性擴增引物，StHb1-F：5′-GCTCTAGACATCAATCATCATGA-3′（下劃線為核酸限制性內切酶XbaI識別位點），StHb1-R：5′-CGGGATCCCCTTCATCTCAGT-3′（下劃線為核酸限制性內切酶BamH I識別位點）.以總RNA為模板，反轉錄獲得cDNA并進行PCR擴增.其循環參數為：預變性94℃3min，循環94℃40s，60℃40s，72℃1min，循環35次，補償延伸72℃10min.擴增產物經10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠回收試劑盒回收目的DNA條帶.

1.2.3 融合表達載體的構建

將PCR擴增獲得的目的基因StHb1的ORF序列片段與載體pBI121-GFP分別用XbaI和BamH I進行分步雙酶切.瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收StHb1基因的ORF序列片段與載體pBI121-GFP大片段DNA.利用T4DNA Ligase將2回收產物進行連接并轉化大腸桿菌DH5α.經卡那霉素（Kan）抗性平板篩選，挑取單克隆提取質粒并進行PCR和酶切鑒定.陽性單克隆送北京六合華大基因股份有限公司進行核酸測序鑒定.以Vector NTI Advance11.0軟件對測序結果進行分析.

1.2.4 重組質粒的農桿菌轉化

參照《分子克隆實驗指南》上的方法，制備農桿菌LBA4404的電轉化感受態細胞.將重組質粒pBI121-StHb1-GFP和空載質粒pBI121-GFP分別電擊轉化農桿菌LBA4404.通過利福平（Rif，50mg／L）和卡那霉素（Kan，50mg／L）篩選獲得陽性克隆.提取質粒并進行PCR及酶切鑒定.

1.2.5 洋蔥內表皮亞細胞定位

參考劉海燕等［10］的方法，將含有pBI121-StHb1-GFP質粒的農桿菌按體積比1／1 000接種于5mL LB液體培養基（含50mg／L Rif和50mg／L Kan），28℃過夜振蕩培養.按照1／50的比例轉接到50mL LB液體培養基（50mg／L Rif，50mg／L Kan和100μmol／L乙酰丁香酮（AS））上，28℃振蕩培養至對數生長期.3 000r／min離心10min收集菌體，并重懸于含10mmol／L MgCl2和100μmol／L AS的MS液體培養基中.OD600調整為0.6左右.

選取新鮮洋蔥中層鱗莖，無菌環境下用體積分數為75%的乙醇浸泡10min后，用無菌水洗滌3～5次.將內表皮切成1cm×1cm大小的方塊，用鑷子撕下內表皮平鋪于MS固體培養基中，28℃暗培養24h；然后，將內表皮置于MS重懸菌液20min，用滅菌濾紙吸干表面菌液并平鋪于MS固體培養基中，在光周期16h／18h，25℃的條件下共培養1d左右.取出洋蔥內表皮細胞，以MS液體培養基清洗并用壓片法制片.于熒光顯微鏡下觀察與拍照.同時，以空載體pBI121-GFP轉化結果作為對照.

2 結果與分析

2.1 StHb1基因的ORF序列片段的克隆

利用TRIquick Reagent試劑提取荷蘭十五（馬鈴薯感性栽培品種）塊莖的總RNA，紫外分光光度計檢測A260／A280比值為1.94，瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1a所示，可以清晰地看到28S與18S2條條帶且比值約為2∶1.以此總RNA為模板，通過RT-PCR技術克隆到StHb1基因的ORF序列片段（如圖1b）.其長度約為500bp，與預期大小（484bp）基本相符.

圖1 馬鈴薯總RNA及StHb1基因ORF片段的克隆Fig.1 Total RNA of potato and cloning of ORF fragment of potato StHb1gene

2.2 融合表達載體的構建

含有目的基因StHb1的ORF序列片段和GFP基因的融合表達載體如圖2所示.

由于載體PBI121-GFP序列分析顯示XbaI與BamH I 2核酸內切酶酶切位點緊鄰，且2內切酶的最適反應溫度不同，因此對StHb1基因的ORF序列片段與載體pBI121-GFP進行分步雙酶切.回收產物以T4DNA Ligase進行連接并轉化大腸桿菌DH5α.經抗生素（Kan）篩選后挑取單克隆提取質粒，以特異性引物StHb1-F與StHb1-R進行PCR擴增鑒定，如圖3a中所示，2和7號重組質粒在預期大小（484bp）處有1條明顯的特異性擴增條帶.用HindⅢ對2和7號質粒進行酶切鑒定（圖3b），瓊脂糖凝膠電泳結果顯示2重組質粒均切出與預期大小（907bp）相符合的DNA條帶.陽性重組菌經測序證明StHb1基因正確插入到載體pBI121-GFP中，與GFP基因形成一個1197bp長度的完全融合ORF，其編碼399個氨基酸的多肽序列，符合實驗設計.

2.3 StHb1-GFP融合蛋白的亞細胞定位

通過農桿菌介導法，將重組質粒導入洋蔥鱗莖內表皮細胞內進行瞬時表達，以空載體pBI121-GFP作為對照，培養1d后在熒光顯微鏡下觀察.圖4b為對照組GFP蛋白的定位情況，其在細胞核與細胞質中均可以看到GFP的綠色熒光信號.而將StHb1基因的ORF插入到GFP的5′端，在洋蔥細胞內表達形成StHb1-GFP融合蛋白，在熒光顯微鏡下觀察發現其主要存在于細胞核中，少量存在于細胞質中，結果如圖4d所示.

圖2 重組載體pBI121-StHb1-GFPFig.2 Recombinant vector pBI121-StHb1-GFP

圖3 重組質粒的鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmids

圖4 StHb1-GFP在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of StHb1-GFP in onion epidermal cells

3 討論

鑒定基因表達產物在細胞中的定位對明確其生物學功能具有重要的意義.GFP因其獨特的性質，可以作為報告基因來研究外源基因產物在細胞中的定位、轉移及相互作用等，現已廣泛用于基因功能研究［10-12］.自1988年首次報道植物非共生血紅蛋白以來［13］，為闡明其生物學功能人們已做了大量的亞細胞和組織定位研究.楊禮香等［14］利用AtGLB1-GFP融合基因表達載體在洋蔥內表皮細胞中瞬時表達來研究擬南芥AtGLB1蛋白亞細胞定位情況，結果表明AtGLB1-GFP融合蛋白大部分位于細胞核，少量分布于細胞質中.曲占良等人［3］的研究也顯示棉花GhHb1-GFP融合蛋白主要分布于細胞核，在細胞質中也存在少量的熒光信號.這些實驗結果與Seregélyes等［15］利用免疫組織化學細胞定位技術對苜蓿MHb1蛋白細胞內定位的研究結果基本相符.同時Ross等［16］對水稻nsHb進行的免疫雜交組織定位分析顯示，nsHb在根冠細胞、薄壁細胞、糊粉層細胞和維管束細胞等正在分化的組織細胞中優勢表達.橡樹非共生血紅蛋白QpHb1原位雜交結果顯示其集中分布于原生木質部、皮層細胞和原表皮［17］.

本研究通過構建StHb1-GFP融合表達載體，采用農桿菌介導法轉化洋蔥鱗莖內表皮細胞，成功實現了StHb1蛋白的亞細胞定位研究.熒光顯微鏡觀察顯示StHb1蛋白主要定位于細胞核內，少量定位于細胞質，該結果與楊禮香、曲占良和Seregélyes等的研究結果基本一致，暗示該基因的功能在高等植物中比較保守.今后，擬采用轉基因方法，將該基因在馬鈴薯植株中過表達或敲低表達，為進一步明確其功能提供更多有力證據.

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Subcellular localization of StHb1protein from potato

LI Jigang，ZHENG Jianpo，QU Zhanliang
（Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

To identify the subcellular location of StHb1protein，a cDNA encoding nonsymbiotic hemoglobin（StHb1）was cloned fromSolanumtuberosumby RT-PCR，and fused to the 5′end of the green fluorescent protein gene to generate plant binary vector pBI121-StHb1-GFP.It was introduced into onion epidermal cells viaAgrobacterium-mediated transformation.Subcellular localization of StHb1protein was detected by fluorescent microscopy.The results showed that the StHb1-GFP fusion proteins were predominantly present in the nucleus.

non-symbiotic hemoglobin；green fluorescent protein（GFP）；subcellular localization；fusion expression vector；Agrobacterium-mediated transformation

Q789

A

1000-1565（2012）05-0523-05

2011-11-23

河北大學博士基金資助項目（2007-097）；河北省教育廳資助項目（2007412）；河北省科技支撐計劃項目（11215529）

李繼剛（1974-），男，山東膠南人，河北大學副教授，博士，主要從事植物基因工程方面研究.

E-mail：lijigang＠hbu.edu.cn

趙藏賞）