鴨肝炎病毒研究進展

陽佑天綜述 郭霄峰 魏平華審閱（ 華南農業大學獸醫學院 廣州 5064 廣州格雷特生物科技有限公司 廣州 50730）

鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)是雛鴨的鴨病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis,DVH)的病原。該病特點為發病急、病程短、傳播快和病死率高，臨床表現為角弓反張,剖檢見肝腫大和大量出血性斑點。鴨肝炎病毒有3個不同的血清型，即血清Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，它們之間無交叉中和反應和交叉保護作用[1]。鴨肝炎病毒常與其他病毒、細菌混合感染，是危害養鴨業的主要疾病之一。

1 歷史與分布

1945年，Levine和Hofstad首先發現Ⅰ型鴨病毒性肝炎，但沒有分離到病原。1949年春，Levine和Fabricant對發生在紐約長島的白色北京鴨雛的一種高度致死性疾病進行了研究，1950年用雞胚分離到病毒[2]。此后在英國、加拿大、德國、意大利、印度、法國、蘇聯、匈牙利和日本等國陸續報道了該病的流行。Ⅰ型病毒性肝炎呈世界性分布，我國南京農業大學和北京農業大學通過病毒中和試驗和血清被動保護試驗，證實我國流行的鴨肝炎病毒屬I型[3]。

1965年在英格蘭的諾福克（Norfolk）首次報道了雛鴨暴發Ⅱ型病毒性肝炎。發病鴨群已免疫過Ⅰ型DHV弱毒，雛鴨交叉免疫保護實驗表明，此次暴發的病原與Ⅰ型鴨肝炎病毒不同，命名為Ⅱ型鴨肝炎病毒。該病原引起的DVH僅在英格蘭East Anglia地區有報道，而且自1980年代中期暴發后，該地區也未見有本病發生。

Ⅲ型鴨肝炎病毒由Toth首次在紐約長島報道。目前只知道美國發生過這種由Ⅲ型鴨肝炎病毒引起的DVH[2]。

2 病原特征

Ⅰ型鴨肝炎病毒最初屬微RNA病毒科腸病毒屬成員。后來，研究發現DHV與小RNA病毒科9個已知屬23種病毒之間的衣殼蛋白以及保守的2C和3D蛋白的氨基酸序列同源性均小于40%，故它們應屬于小RNA病毒科的一個新屬，ICTV小RNA病毒研究組建議稱之為禽肝病毒屬(Avihepatpvirus)[4]。該病毒大小為20～40nm，無囊膜，基因組為單分子線狀正鏈RNA，含有VP1、VP2和VP33種結構蛋白。其中VP1區存在多個免疫優勢輔助性T細胞抗原位點及其抗原決定簇，構成主要的T、B淋巴細胞抗原表位，誘導機體產生中和抗體，且與病毒基因型和血清型的多樣性有關[5]。因此VP1常作為病毒遺傳變異分析的參考依據。N-DHV具有與DHV-Ⅰ相似的分子結構,但其基因組比DHV-Ⅰ稍大[6]。病毒對乙醚、氯仿、胰蛋白酶及常用消毒劑等有一定的抵抗力，能耐受pH 3.0的酸性環境，具有一定的熱穩定性。DHV-Ⅰ不能凝集任何動物或人的紅細胞,病毒可在鴨胚、雞胚和鵝胚的絨毛尿囊腔內增殖[1,3]。在DHV-Ⅰ細胞培養方面，1996年，羅函祿[7]首次在國內使DHV適應雞胚成纖維細胞(CEF)的培養。已有的研究結果表明，鴨胚肝細胞、鴨胚腎細胞和鵝胚腎細胞等均能支持該病毒的生長[8]。但犢牛血清對DHV增殖具有明顯的抑制作用,因此，僅有少數報道描述了該病毒的細胞培養[9]。

Ⅱ型鴨肝炎病毒屬于星狀病毒科星狀病毒屬，暫命名為鴨星狀病毒。該病毒呈球形，因在電鏡下呈現特征性的帶有頂角的星形，而得此名。直徑為27～30nm,基因組為單分子線狀正鏈RNA。病毒可耐受氯仿、pH3、胰酶處理和50℃加熱1h。甲醛熏蒸消毒和標準的消毒措施可消滅污染圈舍中的病毒[1,2]。

Ⅲ型鴨肝炎病毒分類同Ⅰ型鴨肝炎病毒，其形態、大小、核酸及理化特性與Ⅰ型相似。病毒可耐受氯仿、pH3，但對50℃加熱敏感。

3 病原的變異性

1992年，Sandhu報道了Ⅰ型鴨肝炎病毒的變異株DHV-Ⅰa，并通過雞胚交叉中和反應證實DHV-Ⅰa和典型的DHV-Ⅰ存在部分交叉反應[10]。Woolcock通過鴨胚腎細胞空斑減數試驗證明這2個病毒有所不同[11]。在國內，林世棠[12]首先報道Ⅰ型DHV的變異株，其試驗結果與Sandhu相符。隨后，中國臺灣Tseng[13]和韓國Kim[14]陸續分離出了與典型的DHV-Ⅰ基因組結構相近的DHV,稱“臺灣新型”和“韓國新型”,兩種新型之間的血清學關系尚不清楚,但均不與DHV-Ⅰ產生交叉中和反應。2010年，何冉婭[5]對2007～2009年華南地區鴨肝炎病毒進行流行病學調查及變異分析,結果表明華南地區DHV已發生變異,且存在兩種基因型毒株的流行。2011年，Liu[15]報道了中國第一例從鵝中分離到DHV-ⅠJT株病毒，可用抗DHV-Ⅰ的單克隆抗體檢測陽性細胞和細胞質中的病毒抗原。用病毒序列特異性引物PCR擴增，完整的序列表明從鵝分離的JT株與韓國DHV-ⅠC AP-03337株顯示了95.9%的同源性，而與經典的DHV-Ⅰ病毒僅為75.3%。80%雛鵝被JT株感染后均發展為出血性肝炎。張大丙主張將DHV分為血清Ⅰ型、“臺灣新型”和“韓國新型”,分別對應基因A型、B型和C型,對于新的血清型統稱為N-DHV[16]。為了進一步避免典型DHV-I及其變異株和DHV-II，III的混淆,引入了一個新的病毒種名,即將血清Ⅰ型、“臺灣新型”和“韓國新型”歸為鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)[17]。

2006年，KIM[18]對DHA-Ⅰ全基因組進行了測序，證明DHA-Ⅰ有小RNA病毒的基因組基本結構,即僅含一個大的ORF,其兩側分別是5'UTR和3'UTR，3'UTR之后是poly(A)尾。ORF編碼一個聚蛋白,從N端到C端方向,分別為結構蛋白區(P1)和兩個非結構蛋白區(P2和P3)。預測P1區裂解為3種衣殼蛋白 (VP0、VP3和VP1),P2區裂解為4種或5種非結構蛋白(2A1、2A2或2A2+2A3、2B和2C),P3區裂解為4種非結構蛋白(3A、3B、3C和3D)。Wang[19]對2001～2007年得到中國分離株血清Ⅰ型、“臺灣新型”和“韓國新型”3種不同血清型的DHV的VP1、VP0、VP3蛋白全部核苷酸序列和3D蛋白的部分序列進行系統發育分析。發現基于VP1蛋白序列與基于其他3個蛋白序列的基因分群結果非常一致。因此，建議將3個基因群分為DHV A、B和C型。所有典型DHV-Ⅰ株稱為基因型A，分離于“臺灣新型”和“韓國新型”DHV株分別稱為基因型B和C。Jin X[20]對分離于中國湖北省的DHV-ⅠJX高致病株進行序列分析，發現JX株與其他DHV-Ⅰ株有94%～99%的氨基酸水平95%～99%的核苷酸相似性。結果顯示，核苷酸和氨基酸的突變主要分布在VP1基因的序列，暗示VP1很可能是DHV-Ⅰ毒力的主要決定因素。同年，Liu[21]對9個中國東南區的DHV分離株和3個DHV-Ⅰ弱毒疫苗株的VP1基因進行測序，發現分離株和所有疫苗株之間有2個氨基酸的一致替換；羧基末端區通常有最大的變量，在這里分離株和所有疫苗株之間發現6個一致差異，結果表明中國東南部分離鴨肝炎病毒Ⅰ型（DHV-Ⅰ）的VP1基因的遺傳多樣性與分離株制弱有關。王麗艷[22]擴增并測定15株DHV的衣殼蛋白編碼區序列和部分3D序列。結果表明，在同一個基因型內，衣殼蛋白序列高度保守;在不同的基因型間，衣殼蛋白序列高度變異。但在3D氨基酸水平，型內序列高度保守，型間序列亦較為保守。并基于此，初步制定這樣的基因分型標準:型內VP1、VP0、VP3核苷酸和氨基酸序列相似性分別應大于或等于90%和92%、92%和96%、91%和95%，型間VP1、VP0、VP3核苷酸和氨基酸序列相似性分別不超過72%和79%、73%和81%、74%和83%。部分3D核苷酸序列也可用于DHV的基因分型，型內相似性應大于或等于91%，型間相似性不超過82%。

4 鴨肝炎病毒檢測方法

4.1 血清學診斷

血清學方法是目前檢測DHV的主要方法，包括中和試驗、間接血凝試驗、SPA協同凝集試驗、瓊脂凝膠擴散試驗(AGDP)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、熒光抗體技術和空斑減少試驗等。

4.1.1 中和試驗

中和試驗，分為鴨胚、雞胚或病毒適應細胞中和試驗。1950，Levine[23]首次報道該方法應用于DHVI的診斷。1969年，Hwang[24]改進待檢血清和病毒反應的溫度，研究表明DHV-I雞胚中和試驗準確、重復性好。1997年，陳琨[25]用鴨病毒性肝炎病毒及其陽性血清在鴨胚肝細胞單層上進行微量血清中和試驗，結果表明，其敏感性高于鴨胚中和試驗。目前中和試驗仍然是公認的權威方法,但其操作繁瑣、費時,不適于快速診斷，不能進行基層推廣。

4.1.2 間接血凝試驗

間接血凝試驗，即以紅細胞作可溶性抗原的載體來檢測抗體。1996年，孫泉云等[26]粗提DHV經SephadexG200柱層析純化后作為致敏用抗原，戊二醛法固定綿羊紅細胞、BDB法致敏抗原紅細胞，建立了檢測DHV抗體的間接血凝試臉，然而由于非特異性凝血因子的影響，以及不同批次制備的紅細胞在敏感性和穩定性方面有波動，限制了該方法的推廣應用。

4.1.3 SPA 協同凝集試驗

1996年，汪銘書等[27]應用葡萄球菌A蛋白作協同凝集試驗，快速檢測出了鴨肝炎病毒，對DHV攻擊死亡的雛鴨肝臟的檢出率為100%。結果表明SPA-CoA用于檢測DHV的含毒材料，具有較好的敏感性和特異性，適用于臨床及基層推廣。

4.1.4 瓊脂凝膠擴散試驗(AGDP)

1961年，Murty等[28]首次報道采用瓊脂凝膠擴散試驗診斷DHV。1997年，許偉琦等[29]將2%PEG加入到瓊擴試驗中，能大大加快沉淀反應，而且提高了沉淀線清晰度。2002年，張濟培等[30]用氯仿去脂和反透析法進行病毒的提純濃縮,研究鴨肝炎的瓊脂擴散試驗。并發現瓊脂凝膠配制的最佳方案是pH7.2,NaCl為80 g/L和瓊脂糖的質量分數為1%。瓊脂擴散試驗易產生抗原不純的現象,且檢測靈敏度不高。

4.1.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是目前常用的一種簡便、快速、敏感的診斷檢測方法之一。包括競爭ELISA法、間接ELISA法和雙抗體夾心ELISA法等。1990年,趙新柳等[31]最先建立ELISA法檢測鴨病毒性肝炎(DVH)抗體，并與瓊脂免疫擴散試驗(AGDP)進行了比較。結果表明ELISA的特異性與AGDP相一致;而在敏感性方面，ELISA的檢出率為100%，而AGDP為60%。隨著DHV單克隆抗體的研制成功，1992年，陳溥言等[32]建立了夾心ELISA檢測方法，對蔗糖密度梯度離心和柱層析提純病毒的檢測，效果較好。1991年，范偉興等[33]建立Dot-ELISA法，用抗DHV單克隆抗體檢測DHV抗原，并獲成功。除此之外，一些新興的ELISA檢測方法也相繼報道[26,34-40]。ELISA法有簡便、快速及特異性強等優點，但抗原純度要求較高，陰性血清制備存在難度及單克隆抗體尚未商品化供應，推廣受到一定限制。目前國內已有ELISA試劑盒申請專利。

4.1.6 熒光抗體技術

1972年，Maiborda[41]報道熒光抗體技術是檢測接種雛鴨DHV最快速準確的診斷方法。1984年，郭玉璞等[42]運用該方法證實了北京地區流行的DHV由I型DHV引起。免疫熒光抗體法雖然具有快速、靈敏和準確等特點，但其費用較高，對設備的要求也很高，因此在基層推廣應用該方法不太現實。

4.1.7 空斑減少試驗

Woolcock等[43]首先建立了空斑減少試驗檢測DHV中和抗體，報道這一方法比雞胚中和試驗敏感。

4.2 分子生物學診斷

隨著分子生物學技術的飛速發展，以及對DHV基因組研究的不斷深入，分子生物學檢測DHV有多種方法。主要包括RT-PCR方法、巢式RT-PCR和SYBR GreenI熒光定量RT-PCR方法等。

4.2.1 RT-PCR

2007年，馬秀麗等[44]根據Genebank中I型鴨病毒性肝炎病毒的基因序列,設計引物對DHV分離株采用RT-PCR，最低RNA模板檢出量為100pg,成功建立DHV-I的RT-PCR方法，結果表明該方法具有較高的敏感性和特異性。同年，程安春等[45]建立了檢測DHV-I的RT-PCR方法，敏感性達到30 pg，且證明RT-PCR方法比病毒分離和Dot-ELISA具有更高的敏感性。羅玉均等[46]通過目前已發表的DHV-I基因組序列相對保守的區域，設計引物，成功建立了RT-PCR方法檢測鴨肝炎病毒Ⅰ型。王非等[47]根據GeneBank中Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒的基因序列，設計引物對DHV-ⅠZJ-V株采用RT-PCR，結果表明該方法具有較高的敏感性和特異性。2008年，高駿[48]、張祥斌[49]、劉艷萍[50]分別對 DHV-I分離株（S1、S2）、福建 DHV 分離株(DH1～DH6)以及河北、北京和天津 DHV 分離株(HB3、BJ5、TJ1)采用 RT-PCR，結果表明該方法具有較高的敏感性和特異性。隨后，2009年邵澤香[51]、黨龍[52]、何冉婭[53]，2010 年魏雪濤[54]對RT-PCR條件優化，成功建立了Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的鑒別RT-PCR檢測方法。

4.2.2 新型 RT-PCR 方法

2008年，黃顯明[55]建立了適合DHV-I快速檢測的RT-nested-PCR,第1次擴增的敏感性是100 pg,第2次擴增的敏感性是1 fg,第2次比第1次擴增的敏感性高105倍。同年，羅玉均等[56]建立了巢式PCR與SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測方法，結果表明巢式PCR敏感性為6 pg/mL，實時熒光定量RT-PCR確定特異性產物的Tm值為85.6℃,最低能檢測到含0.015 fg/μL陽性質粒標準品，顯示了較好的特異性、敏感性。關育芳[57]、Yang M[58]先后成功地建立了一步法RT-PCR檢測方法。該方法靈敏度高，且一步法的操作，既方便又減少污染的機會，具備了特異、快速和敏感的特點，更加適合于臨床大量樣品的檢測。2011年，孫濤等[59]用RT-PCR結合變性高效液相色譜技術(DHPLC),建立I型鴨肝炎病毒的快速檢測方法。PCR-DHPLC與熒光RT-PCR檢測方法相比較,兩種方法檢測DHV-I的符合率為100%。李嬌等[60]對DHV-I的逆轉錄巢式PCR檢測方法進行優化，該方法第1次擴增的敏感性為100pg，第2次擴增的敏感性達到1pg，敏感性提高了100倍，表明該方法具有良好的敏感性，是一種有效的新方法。

4.2.3 RT-LAMP

反轉錄-環介導等溫擴增 (RT-LAMP)是最早由Notomi等[61]報道的一種新型核酸擴增與檢測方法。即采用能特異識別靶序列上6個位點的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件(60～65℃)下，不到1 h的時間里進行核酸擴增,其擴增效率可達到 109～1010個數量級[62]。2012 年，Song 等[63]建立了快速檢測Ⅰ型鴨肝炎病毒的反轉錄-環介導等溫擴增(RT-LAMP)快速檢測法，研究結果表明該方法與RT-PCR相比，具有更為快速、靈敏及可視化的優點。

5 結語

鴨病毒性肝炎的流行給養鴨業帶來了巨大的經濟損失。加快對鴨肝炎病毒的病原學、變異性、分子生物學和功能基因組研究進程，找出一種快速、靈敏及特異性的檢測方法，對控制該病的傳播和流行極為重要。目前，將基因工程技術運用到檢測方法中,使DHV的檢測更具特異性和敏感性,必將具有良好的應用前景。現在雖然市場上已有較好的DHV弱毒疫苗和滅活疫苗,但是從安全性、高效性等方面來考慮,利用高科技的基因工程技術,研發和推廣基因工程疫苗將在DHV的防控起到至關重要的作用。

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