鴨瘟病毒研究進展

徐曉娟綜述 郭霄峰 魏平華審閱（華南農業大學獸醫學院 廣州 5064 廣州格雷特生物科技有限公司 廣州 50730）

鴨瘟（Duck Plague,DP），又名鴨病毒性腸炎（（Duck Virus Enteritis,DVE），是鴨、鵝和其他雁形目禽類的急性、熱性和敗血性傳染病，是目前對世界范圍內水禽養殖業危害較為嚴重的疫病之一[1]。該病已被世界動物衛生組織認定為B類傳染病，我國動物防疫法也將其列入二類動物疫病[2]。荷蘭學者Baudet[3]于1923年首次發現該病后，其流行范圍逐步擴大，相繼在法國(1949)、美國(1950)、印度(1963)、比利時(1964)、英國 1972)、泰國(1976)和加拿大(1976)被發現。1957年，黃引賢在我國廣州報道發現了鴨瘟。1957～1965年，本病廣泛流行于我國南部、中部和東部的一些養鴨業較為發達的省市[4]，1983年廖德惠報道了四川省存在鴨瘟，并且分離到鴨瘟病毒。至今，全國各地均有本病的報道。目前，鴨瘟仍然是阻礙我國養鴨業發展的重要傳染病之一。

1 鴨瘟病毒基本特性

DP的病原是鴨瘟病毒（DPV），又名鴨病毒性腸炎病毒（DEV），屬皰疹病毒科、皰疹病毒亞科，也稱鴨皰疹病毒Ⅰ型(Duck hcrpcsivirusⅠ)[5]，是一種泛嗜性全身性感染的病毒。

DPV為線性雙鏈DNA病毒，成熟病毒粒子直徑150～380nm，呈球形，有囊膜，在CsCl中浮密度為1.272g/mL，無血凝特性和血細胞吸附作用。除有芯髓、衣殼、囊膜等常見結構外，在衣殼和囊膜間還有皰疹病毒所特有的皮層成分[6]。DPV各毒株在毒力上存在差異，但在免疫學特性上卻是相同的，迄今為止，只發現一種血清型。該病毒對熱、pH及脂溶劑（乙醚、氯仿等）均較敏感，56℃10 min會喪失感染力，80℃5 min即可死亡，在pH3和pH11的環境下也很快被滅活[7]。

2 鴨瘟病毒粒子結構

DPV完整的病毒粒子由芯髓 (core)、衣殼（capsid)、囊膜（envelope）及衣殼和囊膜間的皮層結構（又稱外膜）所組成。病毒芯髓由蛋白與雙股DNA纏繞而成，在衣殼內致密排列，直徑約為35～40nm，也有報道稱為74nm。衣殼為對稱二十面體，表觀呈現正六角形，它由162個相互連接呈放射狀排列且有中空軸孔的殼粒組成，是皰疹病毒最重要的形態特征。芯髓與衣殼一起被稱為核衣殼或裸露的病毒子，直徑約為95～105nm。核衣殼穿過宿主細胞核膜進入胞漿或其空泡中，外面包上一層由蛋白質組成的皰疹病毒所特有的皮層成分，最后繞以囊膜形成成熟的病毒子。余克倫[7]等在電鏡下觀察純化的DPV直徑為184nm,核衣殼直徑92nm,而芯髓在衣殼內排列致密，直徑為74nm，衣殼外包有明顯的囊膜，還可見到多量的囊膜融合的雙病毒顆粒和四病毒顆粒。2008年，郭宇飛等[8]的電鏡負染觀察結果表明，病毒粒子呈圓形,多數直徑為150 nm左右,只有1個核衣殼,少數病毒粒子直徑可達300 nm,有2個或多個核衣殼。

3 鴨瘟病毒的裝配與釋放

經研究報道，DPV可在9～14日齡鴨胚中生長繁殖，并引起胚胎死亡。病毒在鴨胚生長適應以后還可感染雞胚和雞胚成纖維細胞，產生蝕斑并形成核內包涵體。DPV還可在成纖維傳代細胞系CCL-141中生長并具有蝕斑易于觀察的特點,但病毒產量較原代細胞少5.6倍[32]。有研究報道，1株DPV弱毒接種鴨胚成纖維細胞后，對其生長情況進行的研究結果表明，接毒后4 h可在胞內檢測到DPV，在48h病毒滴度達到最高；接毒后6～8 h可在胞外檢測到DPV，在60h病毒滴度達最高，病毒在細胞內的復制周期為6～8 h，成熟病毒子的釋放與細胞發生病變的時間相一致。丁明孝[9]的研究結果進一步證實，DPV DNA的合成是持續進行的，被感染細胞中，病毒DNA的復制與殼體的裝配，病毒粒子的成熟與釋放是同時進行的。對DPV弱毒株在雞胚成纖維細胞中的成熟和釋放方式進行研究發現，DPV獲得囊膜的方式有2種:一是核衣殼可通過空泡出芽的方式獲得囊膜；二是在核內依靠膜物質在核衣殼周圍積累而獲得囊膜。深入研究結果表明，DPV存在2種裝配方式:（1）病毒核衣殼進入宿主細胞后，在核內獲得皮層蛋白，部分核內膜形成囊膜從而成為成熟病毒子，稱為胞核裝配方式；（2）核衣殼通過內外核膜進入胞漿，在其中獲得皮層蛋白，然后通過向高爾基體或者內質網腔出芽釋放時獲得囊膜形成成熟病毒子釋放到細胞外，稱為胞漿裝配方式[10,11]。前者是DEV核衣殼主要的裝配方式。但是，翟中和等[12]通過大量的觀察和應用電子顯微鏡放射自顯影技術，證明了DPV第二種裝配方式的存在，即在細胞質內的裝配過程。其后丁明孝[9]也觀察到DEV在細胞質中的成熟過程。DEV的復制過程，特別是在病毒復制的前期階段，比如基因的轉錄、蛋白合成以及DNA復制等仍然缺乏詳細的資料。

4 鴨瘟病毒基因組結構及分子生物學研究

4.1 DPV 基因組結構

DPV的DNA與其他α-皰疹病毒基因組結構相似，整個基因組由 UL（unique long）區和 US(unique short)區組成，中間有 IR（internal repeat）區相隔，兩端有 TR（terminal repeat）區相連。Ying Wu 等[13]對 DPV CHv株全基因組測序結果表明，該株DPV基因組全長由162175個核苷酸組成，G+C含量為44.89%，與之前報道的DPV基因組G+C含量64.3%不同。該毒株5’UTR長為5685bp，包含25個TATA盒、8個 CAAT盒、8個 poly(A)尾和 1個 GC盒，而 3’UTR則分別包含3個TATA盒、13個CAAT盒、4個poly(A)尾和7個GC盒，一般認為它們均在一定程度上調控基因的轉錄水平。同時，3’UTR擁有7個串聯重復序列，其長度達到40nt，可定義為小衛星。

4.2 DPV分子生物學研究

相對于皰疹病毒科其他成員，人們對DPV基因組的研究起步較晚。1998年，Plummer等用HindⅢ消化DPV得到約1.95kb的DNA片段，對該片段測序分析結果表明，該片段與水痘帶狀皰疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV）的 UL6 和 UL7 部分基因同源[14]。隨后，Hansen等[15]報道了DPV UL30基因的部分序列。2002年，郭霄峰的研究表明:DPV的UL6和UL7基因在不同毒株中高度保守[16]。隨著對DPV基因組結構的深入研究，多個DPV基因現已被成功克隆并進行了序列分析。韓先杰等[17]利用兼并PCR的方法成功克隆了DEV完整的TK、gH、UL24基因和UL25、UL26基因的部分序列，同時實現了gH部分基因、UL24及TK基因在大腸桿菌內的表達；并首次以DEV TK基因作為同源重組的區域，將LacZ基因表達盒插入TK基因內構建鴨瘟病毒轉移載體，為以鴨瘟病毒為載體構建重組鴨瘟病毒活載體疫苗創造了條件。文明[18]等應用鳥槍法成功構建了DPV基因文庫，獲得大于100bp的ORF共187個，首次克隆并鑒定了DPV的核衣殼蛋白基因。陳淑紅[19]、高亞東[20]等研究者應用靶基因步移PCR法分別獲得DPV部分基因的完整ORF，研究結果均指向DPV應歸類為α-皰疹病毒亞科的馬立克氏病病毒屬。李陽[21]分別以DPV UL35、UL50和SORF3部分基因為七點設計引物，擴增出DPV基因組未知序列UL36、UL51～UL55、US2 和 US3。Yan Zhao 等獲得了 DPV US10、US2、US3、US4和US5并對這些基因進行了分子水平上的分析，認為DPV與α-皰疹病毒亞科的同源關系最近。

隨著基因組序列的深入研究，相關基因的功能研究也逐漸開展起來。李慧昕表達了UL27基因中段UL27-MHE UL6基因的UL6-1和UL6-2兩段，應用Western Blotting和間接免疫熒光方法進行了檢測，并制備了針對UL19-C段蛋白的單克隆抗體，擬對UL19抗原表位進行初步定位。潘華奇以純化的重組gB1蛋白作為包被抗原，初步建立了檢測鴨瘟病毒抗體的igB1-ELISA。孫濤等對DPV UL6基因B細胞表位進行了預測以及對其主要抗原域進行了原核表達，以兔抗DPV多克隆抗血清進行Western Blotting分析，多抗血清可與該融合蛋白發生特異性反應。劉峰源對不含信號肽部分的gC基因胞外區進行了原核表達，并證明了糖蛋白gC上含有中和抗原表位并且能夠刺激機體的細胞免疫。金映紅［21］將DEV gH蛋白切除信號肽和跨膜區而保留抗原區的截斷蛋白獲得有效表達，且重組蛋白能與疫苗免疫的DEV陽性血清發生特異性反應，具有較好的抗原反應原性，采用以此表達產物作為抗原建立DEV的血清學檢測方法和研究DEV感染過程中gH的作用研究奠定了基礎。李子劍將綠色熒光蛋白插入到DPV基因TK、US2、US1和US10，證明這四個基因為DPV復制非必需區[22]。

5 分子生物學診斷方法

隨著現代分子生物學的迅速發展，鴨瘟病毒的診斷已經從傳統的診斷方法過渡到如今的分子生物學方法。目前主要利用抗原抗體反應和分子檢測方法對該病作出正確診斷[23]。

現代分子生物學方法包括聚合酶鏈式反應（PCR）、微量固相放射免疫試驗(Micro-SPRIA)、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光試驗（IFA）和斑點雜交(Dot-hybridization)等。近來，郭宇飛等[9]建立了用電鏡負染檢測鴨瘟病毒的方法。隨后，Renyong Jia[24]等建立了有效檢測鴨瘟病毒UL24蛋白的抗原捕獲酶聯免疫吸附法(AC-ELISA)，Chanjuan Shen[25]等又研制出檢測鴨瘟病毒的免疫膠體金層析試紙條。

PCR檢測DPV方法的建立，是在成功獲得了DPV部分保守基因片段核酸序列的基礎上發展起來的，Plummer等［14］于 1998年首次成功利用該方法檢測到鴨瘟病毒(DPV)DNA，并且確定了PCR的最低檢測量為1fg，整個實驗過程僅需36～48h。隨著研究者們的深入研究，目前，應用該方法能夠檢測到1pg[26]甚至0.1pg[27]的病毒DNA，并且檢測時間縮短至12h。2006年，湯承等[28]開發成功的SYBR GreenⅠ實時定量PCR(real-time PCR)檢測技術將檢測時間縮短至3h,對本病的快速診斷具有極其重要的作用。該方法由于其敏感、特異、簡便和快速等特點，對于隱性帶毒狀態禽類的檢測具有重要意義，目前已有應用該方法對鴨群進行檢疫的報道[29]。但是，PCR檢測方法需要較昂貴的儀器和試劑，并且在進行血液檢測時，偶爾會出現嚴重的拖尾現象，影響結果的判斷，此外，還要求獸醫工作者具有良好的操作技能，因此，該方法不適宜在基層推廣。

微量固相放射免疫試驗（Micro-SPRIA）的原理是抗原抗體結合反應,該技術是利用表面能吸附抗體的塑料或其他材料作為固相載體，用同位素標記抗體或抗原，以測定相應抗原或抗體的一種微量檢測技術[30]。該技術廣泛應用于各種病原的檢測，徐耀基等[31]于1992年便開始使用Micro-SPRIA檢測DPV，該方法可直接檢測肝、脾、腦及血清等病料，人工發病48h后陸續從病鴨、鵝的肝、脾、腦及血清等材料中檢出DPV，其中肝、腦的檢出率為80%，最高可達到100%。它能夠在感染DPV的鴨鵝剛出現體溫升高特征性癥狀和病變尚未出現之前對該病進行檢測，適宜發病早期的診斷。Micro-SPRIA特異性強、敏感性高、快速和經濟，標記抗體對抗原純度要求不高，可廣泛應用于微量可溶性抗原、抗體的檢測，對疫情監測和交通口岸的鴨檢疫具有重要的應用價值。

ELISA方法用于DPV病原檢測具有簡便、快速、敏感、特異等優點,能在臨床癥狀出現之前從肝、脾、糞便和血液中檢出DPV,采集的病料只需經過勻漿、凍融和離心等步驟處理后即可用于檢測,適宜于對該病的檢疫和早期診斷[32]。目前已有多種商品化的間接ELISA檢測鴨瘟的試劑盒面市，特別適用于對大批血清樣品ELISA效價的檢測。

抗原捕獲ELISA（AC-ELISA）方法是利用兩種純化后的抗體通過夾心作用捕獲樣品中的相應抗原從而達到檢測目的的一種方法，該方法快速、敏感、特異及可靠。2009年，Renyong Jia[24]等建立了有效檢測鴨瘟病毒UL24蛋白的抗原捕獲ELISA方法，該方法建立在重組DPV UL24蛋白多克隆抗體的基礎上，對人工感染的病鴨血清進行檢測，最低檢出量為46ng/100μL。試驗結果表明，AC-ELISA能特異性檢測到DPV，并且與其他病毒或菌株無交叉反應性，對鴨病毒性肝炎病毒（DHV）、鴨乙型肝炎病毒（DHBV）、小鵝瘟病毒(GPV)、鴨疫里默氏桿菌（R.A.）、大腸桿菌（E.coli）、巴氏桿菌（P.M.)以及腸炎沙門氏菌（S.E.）的檢測結果均為陰性，與PCR和病毒分離試驗的陽性符合率為100%。AC-ELISA方法能夠短時間內準確、快速地直接檢測大批量樣品中的DPV抗原,明顯優于病毒分離和免疫熒光等方法，而且具有半自動化的特點,能自動顯示結果，更適合于各級獸醫研究機構和生產單位應用。

膠體金免疫層析技術(Gold immunochromatography assay,GICA)是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術。其原理是:以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(抗原或抗體)發生高特異性、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶),運用可目測的標記物(膠體金)而得到直觀的實驗現象(顯色)。2010年，Chanjuan Shen[25]等首次制成檢測血液樣品中DPV抗體的免疫膠體金快速診斷試紙，試驗中，以純化的重組DPV UL51蛋白和羊抗兔IgG作為示蹤標記物，對人工分別感染多種鴨病原微生物的鴨血清進行檢測，結果表明，該免疫層析試紙條能夠特異性檢測到DPV 抗體，對 DHV，R.A.，E.coli，MPV，鴨流感病毒（DIV)的檢測結果均為陰性。同時，將血清樣品按1:128的比例稀釋時，檢測結果仍呈現陽性，表明其敏感性高。對110份DPV陽性血清樣品同時用GICA、ELISA和NT 3種方法進行檢測，結果表明，GICA方法的敏感性與ELISA方法相當，但遠遠高于血清中和試驗（NT），并且該方法經濟、快速（10～15分鐘即可顯示結果）、易于操作、不需要特殊的儀器設備。膠體金免疫層析技術是在酶免疫結合試驗的基礎上發展起來的，作為當今檢測病原體敏感的免疫學技術之一,不僅操作簡便、快速、特異,更為重要的是適用于廣大基層單位，并能在現場作檢測。

6 疫苗研制

目前，對于鴨瘟尚無特效藥物治療，為防止該病的發生，鴨場必須建立健全合理的管理制度及衛生防疫制度，同時，在綜合防制的基礎上，重點進行疫苗預防。目前，能用于DP預防的疫苗分為滅活疫苗和弱毒疫苗兩大類，其中的滅活苗包括臟器滅活疫苗、雞胚滅活疫苗、鴨胚滅活疫苗等，弱毒苗包括雞胚化弱毒疫苗、雞胚化弱毒細胞疫苗、自然弱毒疫苗等。國內通常使用弱毒疫苗對鴨群進行免疫，認為兩類疫苗中弱毒疫苗免疫效果更好，使用弱毒疫苗免疫的鴨體僅產生低水平中和抗體，但受強毒攻擊時可使鴨體產生明顯的血清記憶反應[33]。由于生產需要，一些聯苗也相繼被開發出來。程安春等[34]于1997年開發出來的鴨瘟-鴨病毒性肝炎弱毒二聯疫苗免疫后對本病也具有良好的預防作用，其保護期可達9個月。此外，若種鴨體內具有很高的DPV中和抗體水平，其可通過母源抗體傳遞作用使下一代雛鴨獲得對本病的被動免疫保護，該雛鴨在2日齡和4日齡時對攻毒感染可產生完全的抵抗而13日齡時則產生50%的死亡率,這表明該被動免疫很快消退。使種鴨產生高水平中和抗體的方法是將種鴨暴露于自然感染該病的環境中，因為僅靠疫苗接種難以產生足夠水平的中和抗體。Sarmah等[35]報道，DPV弱毒株接種后18 h尚無保護作用,24h后即出現70%的攻毒保護率,推測疫苗株對強毒株的免疫干擾作用是該保護力迅速產生的原因。

目前的DPV弱毒疫苗，都需做肌肉或皮下接種，這對大群免疫極不方便。因此學者們都在致力于口服弱毒疫苗的研制。另外，研制鵝用的DEV疫苗也是當前的一個課題。

隨著DNA重組技術的發展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速發展，其中重組病毒活載體疫苗成為當前新型疫苗的研究熱點。DPV作為皰疹病毒同樣具有充當基因工程疫苗載體的條件，韓先杰等[17]以DEV TK基因作為同源序列成功構建了轉移載體，為進一步構建重組病毒活載體疫苗搭建了物質平臺。邢明偉[36]分別構建了含有AIV H7 HA和H9 HA基因的重組DPV轉移載體，將為重組病毒疫苗的研制奠定基礎。

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