胃腸道間質瘤預后相關的分子標志物研究進展

林 慧，陳遠欽(綜述)，邱建龍(審校)

(中國人民解放軍第180醫院病理科，福建泉州362000)

胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumors，GISTs)是最常見的胃腸道間葉源性腫瘤。GISTs的生物學行為復雜，從良性到高度惡性跨度很大，因此準確判斷其良惡性及惡性程度，對于制訂正確的治療方案顯得尤為重要。目前廣泛采用的GISTs危險度分級方案主要是依據腫瘤原發部位、大小(直徑)以及核分裂數等，除此之外，特定的組織形態、基因突變類型以及其他遺傳學改變均能影響腫瘤預后。如何準確評價及綜合這些因素的預后判斷價值，仍是一個難題。近年來，GISTs分子水平的研究取得了突破性的進展，與GISTs預后相關的分子標志物不斷被發現，為此需更深層次了解分子標志物的預后意義。

1 細胞周期調控相關的分子標志物

1.1 細胞增殖 Ki-67作為細胞增殖活性的分子標志，在細胞周期的絕大多數時期均可見表達。目前，Ki-67指數已被用于多種腫瘤的預后判斷。統計學多因素分析顯示Ki-67可以作為獨立的預后因子，其指數與核分裂相較為一致，能更客觀地反映細胞的增殖度，因此許多研究都用它來作為參照［1-3］。微型染色體維持蛋白是一種新的細胞增殖標志，其表達水平與GISTs的預后呈負相關，同時其敏感性要優于 Ki-67［4］。但目前關于微型染色體維持蛋白的研究數量較為有限，其價值還有待明確。

1.2 細胞周期調控 在腫瘤的發生、發展過程中，細胞周期調控異常占據關鍵的環節，其中以G1/S和G2/M這兩個期相轉變的調節最為重要。

1.2.1 G1/S轉換調控 p16是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因2A的編碼產物之一，能夠抑制周期蛋白依賴性激酶4/6介導的Rb基因磷酸化，低磷酸化的pRb蛋白與轉錄因子E2F1結合，從而阻止細胞從G1期進入S期［5］。p16調控網絡每個環節的異常改變均能影響正常的細胞周期，如周期素(cyclin)D的過表達或是Rb的失活，從而導致多種實體腫瘤的發生、發展［6］。Mitomi等［7］發現 p16 的陰性表達提示GISTs預后較差，同時p16表達下調也出現在部分低危險度GISTs，說明p16的改變可能是腫瘤發生的早期事件。Romeo等［8］應用組織芯片研究了353例GISTs與預后相關的標志物，發現p16的表達下調與腫瘤的進展有關，而這個現象則在胃部GISTs中更加常見。因此，p16缺失可能代表一組預后更差的GISTs亞型。然而，有些研究結果則發現在高危GISTs，p16的表達意味著腫瘤更易于轉移及復發［9-10］。多種因素可能造成這些研究差異，如抗體的種類及濃度、采用的臨界值、隨訪期的長短等。

同時，Mitomi等［7］還研究了GISTs中p16調控通路相關基因(p16、cyclin D1、pRb、DP-1、E2F-1 和 cyclin E)之間的關系，聚類分析結果顯示，p16甲基化及pRb下調表達與腫瘤的臨床高侵襲性相關。因而，pRb的下調表達在惡性GISTs中更為多見［11］。

E2F1是一種多功能的轉錄因子，是細胞增殖調控的中心環節，其表達與pRb呈負相關。在低危及高危 GISTs中，E2F1的表達率分別為 33.3%和92.9%，其mRNA及蛋白表達水平與腫瘤的核分裂數及增殖率呈正相關［11］。因此，E2F1的過表達有可能與ki-67指數一起用于GISTs的預后評估［12］。

1.2.2 G2/M 轉換調控 CHFR(checkpoint with forkhead and ring finger)是有絲分裂前期檢查點基因，通過保持 Aurora-A、Aurora-B、Plk1和 cyclin B1/cdc2滅活，抑制cyclin B1進入細胞核使細胞延遲在G2期［13］。目前已在多種腫瘤中發現CHFR的過表達，其表達程度與有絲分裂指數密切相關，并可能提示腫瘤的預后［14-15］。CHFR啟動子的甲基化是其表達下調的原因，但是在GISTs中，CHFR的甲基化并不常見，因此DNA拷貝數的改變可能是另一個重要機制［16-17］。Fujita等［1］對53 例胃部原發的 GISTs進行免疫組織化學檢測，發現CHFR的下調表達與高危險度GISTs及高分裂指數密切相關，但與其他的調控因子表達無明顯關系，因而認為CHFR并不具有獨立的預后判斷價值，而其他參與G2/S轉換期調控的因子中cyclin A、cyclinB1、cdc2等表達程度與Ki-67指數相關，可能用于判斷GISTs的生物學行為。

2 細胞凋亡相關的分子標志物

細胞凋亡和細胞增殖是一對并存的矛盾，正常情況下兩者處于動態平衡，腫瘤的發生即是兩者失調的結果。不同的腫瘤，腫瘤細胞的凋亡程度不盡一致。同時，細胞凋亡也可能降低腫瘤浸潤及轉移的能力。

2.1 p53 p53基因是最廣為人知的腫瘤抑制基因，與細胞凋亡有密切關系，野生型p53能夠促進細胞凋亡，而突變型 p53基因對凋亡則有抑制作用。Menéndez等［18］對68 例 GISTs進行回顧性分析，發現p53的表達與腫瘤的復發及轉移有關，因而具有一定的預后參考價值。Kim等［19］對136例≤5 cm的胃GISTs術后病例進行隨訪，結果發現高核分裂指數是復發的重要預后指標，而p53的異常表達則與復發密切相關。

2.2 Bcl-2 Bcl-2基因的主要作用是抑制細胞凋亡和延長細胞存活。兩者均參與多種腫瘤的發生發展。Bcl-2的陽性表達通常意味著GISTs預后較差，但接受伊馬替尼治療的患者中Bcl-2表達上調卻有更長的無進展生存期［20-21］。同時，另一些研究結果則顯示，p53和Bcl-2的表達情況與GISTs的預后無關，因而兩者的預后判斷價值還有待深入的研究［22-23］。

2.3 程序性細胞死亡因子4 程序性細胞死亡因子4(programmed cell death faltor4，PDCD4)是新發現的細胞凋亡相關基因，近年來研究發現其在多種腫瘤中下調表達，可能作為一種抑癌基因參與腫瘤的發生發展［24-25］。PDCD4具體的作用機制尚未清楚，可能與轉錄因子AP-1及β-catenin/Tcf信號轉導通路有關。Ding等［26］首次對 GISTs中PDCD4的表達情況進行研究，發現腫瘤組織中PDCD4的mRNA(68%)及蛋白(66.7%)表達下調，并推斷可能有多種機制在不同水平參與PDCD4的調控。在這項研究中，PDCD4的表達與多種臨床病理參數相關，包括腫瘤大小、核分裂數等，同時與Ki-67標志指數直接相關，因此PDCD4有可能是GISTs惡性進展過程中的一個關鍵因素，同時也具有預后判斷的價值。

3 腫瘤侵襲與轉移相關的分子標志物

3.1 CD44與骨橋蛋白 CD44屬于細胞黏附分子家族成員，是一種分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，主要參與異質性黏附，在腫瘤細胞侵襲轉移中起促進作用。Montgomery等［27］應用組織芯片研究標準型CD44(CD44s)及各種變異亞型(CD44v3-v6和v9)在GISTs中的表達情況，發現盡管CD44s在胃部GISTs表達程度存在差異，但只有CD44s表達缺失才能提示預后較差。CD44在受到特定刺激時發生蛋白酶解是與其作用機制相關的一個重要特性，其裂解位點包含多種功能組件以及與其他蛋白的結合位點。

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種帶負電的非膠原性骨基質糖蛋白，作為一種機體反應蛋白參與多種生理病理過程。Hsu等［28］在GISTs腫瘤組織及細胞系中應用原位鄰位連接分析均證實了OPN與CD44之間的相互作用，OPN可能是通過誘導CD44裂解啟動下游的信號轉導通路從而參與腫瘤進展。OPN過表達可以作為獨立的負性預后因素用于判斷腫瘤切除術后的復發風險。另一項研究［29］則探討了CD44裂解活性與臨床病理參數及cyclin D1、β-catenin、OPN表達之間的聯系，多因素分析結果顯示CD44裂解活性與核分裂指數呈正相關，提示預后較差。cyclin D1，β-catenin的表達與CD44裂解活性呈正相關，提示三者在細胞周期調控中可能存在密切的聯系。

3.2 聚束蛋白 聚束蛋白是一種肌動蛋白交聯蛋白，參與細胞的運動和黏附。聚束蛋白在正常的間葉組織及神經組織中普遍表達，其在腫瘤中表達上調也已見報道，但具體的作用機制尚不清楚。Ozcan等［30］應用免疫組織化學研究了聚束蛋白在30例GISTs的表達情況，僅有5例為中到強陽性，均為高危險度GISTs，同時在染色強度上與組織類型、腫瘤原發部位有關，上皮細胞型、小腸GISTs要高于梭形細胞型及胃GISTs。雖然病例數有限，但這些現象均體現了聚束蛋白作為預后標志的潛在價值。

3.3 埃茲蛋白 埃茲蛋白是膜細胞骨架連接蛋白，作為埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白家族成員之一，在細胞運動黏附、信號轉導和細胞周期調控中起重要作用，其在腫瘤侵襲轉移方面的作用也逐漸受到重視。Wei等［31］發現有66%的 GISTs過表達埃茲蛋白，部位間差異顯著，在胃以外多見，盡管其表達與美國國立衛生研究院提出的危險度分級，Ki-67增殖指數等因素無明顯關系，但多因素分析結果顯示其過表達仍可作為獨立的負性預后因素。

3.4 上皮鈣黏附素 上皮鈣黏附素(epithelial cadherin，E-cadherin)屬鈣黏附素家族，是介導表皮細胞間黏附及同類細胞間相互作用的主要黏附分子。E-cadherin作為一種抗侵襲分子，其低表達可促進癌細胞侵襲和轉移。Dysadherin則是一種能下調E-cadherin表達、降低細胞間黏附的抗黏附分子。Liang等［32］發現dysadherin的表達水平與 GISTs的危險度相關，與年齡、性別、組織類型及原發部位無關。Dysadherin過表達導致E-cadherin缺失可能是GISTs復發和轉移的機制之一。先前則已有研究發現E-cadherin基因的甲基化可能是GISTs早期復發的一個獨立預后指標［33］。

3.5 局部黏著斑激酶 局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一個多功能的非受體型酪氨酸激酶，在細胞接觸及細胞與胞外基質黏附中起重要作用。FAK在多種惡性腫瘤中過度表達，與腫瘤的進展及惡化相關。Kamo等［34］的研究結果顯示86.3%(44/51)的 GISTs表達 FAK，其 5年生存率(66.5%)明顯低于FAK陰性者(100%)，提示FAK的過表達可能與GISTs的惡性進展相關。Sakurama等［35］則證實FAK及其下游信號通路的持續激活與GISTs特定突變類型(KIT820Tyr)對伊馬替尼耐藥有關。因此FAK也可能是伊馬替尼耐藥GISTs的一個潛在治療靶點。

4 其他分子標志物

4.1 鉀通道四聚結構域12 隨著分子生物學技術的進展，新的分子標志物不斷出現，盡管其在GISTs中的作用尚未完全清楚，但在GISTs的預后判斷上已經體現出一定的價值。鉀通道四聚結構域12(potassium channel tetramerisation domain containing 12，KCTD12)又稱Pfetin蛋白，是近年才發現的與GISTs危險度呈負相關的標志物。蛋白免疫印跡法和實時聚合酶鏈反應結果均提示Pfetin的表達與腫瘤轉移相關，結合210例GISTs病例的臨床資料及其免疫組化結果則發現，Pfetin表達陽性者的5年生存率(93.9%)遠高于陰性者(36.2%)［36］。隨后的一些研究收集了更大的樣本量(299例)，并得出類似的結論。多因素分析結果顯示Pfetin表達是一個獨立的預后因素，可用于臨床判斷GISTs患者是否應該接受靶向藥物治療［37-38］。

4.2 碳酸酐酶Ⅱ 碳酸酐酶Ⅱ(carbonic anhydraseⅡ，CAⅡ)是最近報道的一個GISTs診斷標志物。約95%的GISTs(175例)表達CAⅡ，并與腫瘤原發部位、組織類型及基因突變無關，而高表達CAⅡ的病例預后較好則提示其可能作為GISTs的預后標志，但目前尚欠缺足夠的證據支持［39］。

4.3 中期因子 中期因子(midkine，MK)是一種肝素結合生長因子，作為一種多功能的細胞因子，與腫瘤發生、轉移及耐藥均有密切聯系。Kaifi等［40］應用免疫組織化學發現MK在55%(31/57)的GISTs中表達陽性，與腫瘤核分裂象明顯相關，而與腫瘤大小無關，多因素分析則顯示其為獨立的預后因素，MK表達陽性者預后更差。血清MK的濃度也具有判斷腫瘤進展及預后的潛在價值，同時它在GISTs發生、發展中所起的作用及其對伊馬替尼療效判斷上的價值也值得深入研究［41］。Zander等［42］在另一項研究中則發現神經細胞黏附分子配體1在74%的GISTs病例中表達，也可作為預后判斷的血清標志物，其高表達提示腫瘤有浸潤和轉移的風險。

5 結語

GISTs的生物學行為比較獨特，目前的危險度分級雖能較好地判斷其行為，但是對于更深層次的機制問題，目前的認識還遠遠不足。各種預后相關的分子標志物不斷被發現，在加深對GISTs生物學行為認識的同時，也可能帶來更多的疑惑。綜合分析現有的研究結果，在復雜的調控網絡中尋找關鍵點，對于GISTs的預后判斷、分類及治療至關重要，這也是當今腫瘤研究的趨勢之一。

［1］Fujita A，Yamamoto H，Imamura M，et al.Expression level of the mitotic checkpoint protein and G2-M cell cycle regulators and prognosis in gastrointestinal stromal tumors in the stomach［J］.Virchows Arch，2012，460(2):163-169.

［2］Nemoto Y，Mikami T，Hana K，et al.Correlation of enhanced cell turnover with prognosis of gastrointestinal stromal tumors of the stomach:relevance of cellularity and p27kip1［J］.Pathol Int，2006，56(12):724-731.

［3］Nilsson B，Bümming P，Meis-Kindblom JM，et al.Gastrointestinal stromal tumors:the incidence，prevalence，clinical course，and prognostication in the preimatinib mesylate era——a population-based study in western Sweden［J］.Cancer，2005，103(4):821-829.

［4］Huang HY，Huang WW，Lin CN，et al.Immunohistochemical expression of p16INK4A，Ki-67，and Mcm2 proteins in gastrointestinal stromal tumors:prognostic implications and correlations with risk stratification of NIH consensus criteria［J］.Ann Surg Oncol，2006，13(12):1633-1644.

［5］Vernell R，Helin K，Müller H.Identification of target genes of the p16INK4A-pRB-E2F pathway［J］.J Biol Chem，2003，278(46):46124-46137.

［6］Haller F，Gunawan B，von Heydebreck A，et al.Prognostic role of E2F1 and members of the CDKN2A network in gastrointestinal stromal tumors［J］.Clin Cancer Res，2005，11(18):6589-6597.

［7］Mitomi H，Fukui N，Kishimoto I，et al.Role for p16(INK4a)in progression of gastrointestinal stromal tumors of the stomach:alteration of p16(INK4a)network members［J］.Hum Pathol，2011，42(10):1505-1513.

［8］Romeo S，Debiec-Rychter M，Van Glabbeke M，et al.Cell cycle/apoptosis molecule expression correlates with imatinib response in patients with advanced gastrointestinal stromal tumors［J］.Clin Cancer Res，2009，15(12):4191-4198.

［9］Steigen SE，Bjerkehagen B，Haugland HK，et al.Diagnostic and prognostic markers for gastrointestinal stromal tumors in Norway［J］.Mod Pathol，2008，21(1):46-53.

［10］Schmieder M，Wolf S，Danner B，et al.p16 expression differentiates high-risk gastrointestinal stromal tumor and predicts poor outcome［J］.Neoplasia，2008，10(10):1154-1162.

［11］Sabah M，Cummins R，Leader M，et al.Altered expression of cell cycle regulatory proteins in gastrointestinal stromal tumors:markers with potential prognostic implications［J］.Hum Pathol，2006，37(6):648-655.

［12］Tetikkurt US，Ozaydin IY，Ceylan S，et al.Predicting malignant potential of gastrointestinal stromal tumors:role of p16 and E2F1 expression［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2010，18(4):338-343.

［13］Summers MK，Bothos J，Halazonetis TD.The CHFR mitotic checkpoint protein delays cell cycle progression by excluding cyclin B1 from the nucleus［J］.Oncogene，2005，24(16):2589-2598.

［14］Ogi K，Toyota M，Mita H，et al.Small interfering RNA-induced CHFR silencing sensitizes oral squamous cell cancer cells to microtubule inhibitors［J］.Cancer Biol Ther，2005，4(7):773-780.

［15］Kobayashi C，Oda Y，Takahira T，et al.Aberrant expression of CHFR in malignant peripheral nerve sheath tumors［J］.Mod Pathol，2006，19(4):524-532.

［16］Igarashi S，Suzuki H，Niinuma T，et al.A novel correlation between LINE-1 hypomethylation and the malignancy of gastrointestinal stromal tumors［J］.Clin Cancer Res，2010，16(21):5114-5123.

［17］Soutto M，Peng D，Razvi M，et al.Epigenetic and genetic silencing of CHFR in esophageal adenocarcinomas［J］.Cancer，2010，116(17):4033-4042.

［18］Menéndez P，Padilla D，Cubo T，et al.Biological behavior due to cell proliferation markers of gastrointestinal stromal tumors［J］.Hepatogastroenterology，2011，58(105):76-80.

［19］Kim MY，Park YS，Choi KD，et al.Predictors of recurrence after resection of small gastric gastrointestinal stromal tumors of 5 cm or less［J］.J Clin Gastroenterol，2012，46(2):130-137.

［20］Steinert DM，Oyarzo M，Wang X，et al.Expression of Bcl-2 in gastrointestinal stromal tumors:correlation with progression-free survival in 81 patients treated with imatinib mesylate［J］.Cancer，2006，106(7):1617-1623.

［21］Changchien CR，Wu MC，Tasi WS，et al.Evaluation of prognosis for malignant rectal gastrointestinal stromal tumor by clinical parameters and immunohistochemical staining［J］.Dis Colon Rectum，2004，47(11):1922-1929.

［22］Neves LR，Oshima CT，Artigiani-Neto R，et al.Ki67 and p53 in gastrointestinal stromal tumors——GIST［J］.Arq Gastroenterol，2009，46(2):116-120.

［23］Feakins RM.The expression of p53 and bcl-2 in gastrointestinal stromal tumours is associated with anatomical site，and p53 expression is associated with grade and clinical outcome［J］.Histopathology，2005，46(3):270-279.

［24］Wei ZT，Zhang X，Wang XY，et al.PDCD4 inhibits the malignant phenotype of ovarian cancer cells［J］.Cancer Sci，2009，100(8):1408-1413.

［25］Mudduluru G，Medved F，Grobholz R，et al.Loss of programmed cell death 4 expression marks adenoma-carcinoma transition，correlates inversely with phosphorylated protein kinase B，and is an independent prognostic factor in resected colorectal cancer［J］.Cancer，2007，110(8):1697-1707.

［26］Ding L，Zhang X，Zhao M，et al.An essential role of PDCD4 in progression and malignant proliferation of gastrointestinal stromal tumors［J］.Med Oncol，2011.

［27］Montgomery E，Abraham SC，Fisher C，et al.CD44loss in gastric stromal tumors as a prognostic marker［J］.Am J Surg Pathol，2004，28(2):168-177.

［28］Hsu KH，Tsai HW，Lin PW，et al.Osteopontin expression is an independent adverse prognostic factor in resectable gastrointestinal stromal tumor and its interaction with CD44promotes tumor proliferation［J］.Ann Surg Oncol，2010，17(11):3043-3052.

［29］Hsu KH，Tsai HW，Lin PW，et al.Clinical implication and mitotic effect of CD44cleavage in relation to osteopontin/CD44interaction and dysregulated cell cycle protein in gastrointestinal stromal tumor［J］.Ann Surg Oncol，2010，17(8):2199-2212.

［30］Ozcan A，Karslioˇglu Y，Günal A，et al.Fascin expression and its potential significance in gastrointestinal stromal tumors［J］.Turk J Gastroenterol，2011，22(4):363-368.

［31］Wei YC，Li CF，Yu SC，et al.Ezrin overexpression in gastrointestinal stromal tumors:an independent adverse prognosticator associated with the non-gastric location［J］.Mod Pathol，2009，22(10):1351-1360.

［32］Liang JF，Zheng HX，Xiao H，et al.Dysadherin expression in gastrointestinal stromal tumors(GISTs)［J］.Pathol Res Pract，2009，205(7):445-450.

［33］House MG，Guo M，Efron DT，et al.Tumor suppressor gene hypermethylation as a predictor of gastric stromal tumor behavior［J］.J Gastrointest Surg，2003，7(8):1004-1014.

［34］Kamo N，Naomoto Y，Shirakawa Y，et al.Involvement of focal adhesion kinase in the progression and prognosis of gastrointestinal stromal tumors［J］.Hum Pathol，2009，40(11):1643-1649.

［35］Sakurama K，Noma K，Takaoka M，et al.Inhibition of focal adhesion kinase as a potential therapeutic strategy for imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor［J］.Mol Cancer Ther，2009，8(1):127-134.

［36］Suehara Y，Kondo T，Seki K，et al.Pfetin as a prognostic biomarker of gastrointestinal stromal tumors revealed by proteomics［J］.Clin Cancer Res，2008，14(6):1707-1717.

［37］Kikuta K，Gotoh M，Kanda T，et al.Pfetin as a prognostic biomarker in gastrointestinal stromal tumor:novel monoclonal antibody and external validation study in multiple clinical facilities［J］.Jpn J Clin Oncol，2010，40(1):60-72.

［38］Kubota D，Orita H，Yoshida A，et al.Pfetin as a prognostic biomarker for gastrointestinal stromal tumor:validation study in multiple clinical facilities［J］.Jpn J Clin Oncol，2011，41(10):1194-1202.

［39］Parkkila S，Lasota J，Fletcher JA，et al.Carbonic anhydraseⅡ.A novel biomarker for gastrointestinal stromal tumors［J］.Mod Pathol，2010，23(5):743-750.

［40］Kaifi JT，Fiegel HC，Rafnsdottir SL，et al.Midkine as a prognostic marker for gastrointestinal stromal tumors［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2007，133(7):431-435.

［41］Rawnaq T，Kunkel M，Bachmann K，et al.Serum midkine correlates with tumor progression and imatinib response in gastrointestinal stromal tumors［J］.Ann Surg Oncol，2011，18(2):559-565.

［42］Zander H，Rawnaq T，von Wedemeyer M，et al.Circulating levels of cell adhesion molecule L1 as a prognostic marker in gastrointestinal stromal tumor patients［J］.BMC Cancer，2011，11(189):1-7.