內皮祖細胞為載體的基因治療

葛夏青(綜述)，孫喜太(審校)

(1.東南大學醫學院，南京210009;2.南京市鼓樓醫院肝膽外科，南京210008)

腫瘤的生長、侵襲以及轉移都具有血管依賴性［1］。最初對腫瘤血管的研究聚焦在腫瘤誘發的血管新生，即在原有血管基礎上向腫瘤組織方向以出芽方式形成血管的過程。然而，進一步的研究發現一種新的血管生成機制，即所謂的血管生成，它是指由骨髓分化而來的原始細胞，即內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，從骨髓釋放并歸巢至腫瘤血管新生位點參與血管新生的過程［2］。Asahara 等［3］于 1997年首先用免疫磁珠從外周血中分離出CD34+/血管內皮細胞生長因子受體2+血管EPCs，它是內皮細胞的前體細胞，具有向內皮細胞分化的潛能，并參與腫瘤血管新生。隨后，大量研究證實骨髓來源的EPCs參與腫瘤新生血管的形成。近幾年來，關于此方面大量的人和動物的研究使人們更加深入地理解了EPCs在腫瘤血管發生過程中的作用［4］。基因治療是指將有治療作用的基因通過一定方式導入靶細胞以發揮治療作用，從而達到治療疾病的目的［5］。在基因治療過程中，為使基因能定向傳遞到特定的靶細胞中，就必須有一個合適的靶向轉移載體系統。EPCs能夠靶向性聚集到腫瘤部位和缺血損傷部位的特性受到人們的關注。相關研究支持EPCs能夠作為靶向載體的假說［6］。EPCs有靶向性高，系統毒性低的特點，有望成為腫瘤及其他方面基因治療的理想載體。

1 EPCs的來源、培養、鑒定

胚胎第15天左右卵黃囊出現扁平狀的細胞，為早期的EPCs，參與胚胎期血管發生，出生后EPCs定居于骨髓組織，機體需要時能在粒細胞集落刺激因子、粒-巨噬細胞集落刺激因子及血管內皮生長因子等細胞因子的作用下，從骨髓中動員到外周循環歸巢，到缺血組織參與血管新生［7］。

Asahara等［3］在1997年第1個描述了成體外周血中骨髓來源的EPCs。目前沒有在體外分離培養EPCs的標準程序［8］。最普遍采用的是將骨髓或外周血經淋巴細胞分離液分離后，直接或再通過磁珠分選后的細胞放入經明膠或膠原裱襯的培養瓶中，培養液為添加胎牛血清、血管內皮生長因子、胰島素樣生長因子1、成纖維細胞生長因子b、表皮細胞生長因子的培養基。不同培養時間的EPCs可能呈橢圓形、長梭形、紡錘形，在形態上無法與其他細胞區分開來，主要靠細胞表面標志來識別。EPCs細胞表面的標志有CD34、CD133(AC133)、c-Kit、Sca-1、DiIAc-LDL、vWF、血管內皮細胞生長因子受體2(KDR，Flk-1)。但是，由于干/祖細胞標志CD133、CD34或血管內皮細胞生長因子受體2既能在EPCs上，也能在造血干細胞上找到，血管內皮鈣黏蛋白或內皮細胞選擇素是內皮系特殊標記，但也出現在一部分EPCs上，因此EPCs包括處于從造血-血管祖細胞到分化內皮細胞，目前并沒有發現唯一能將EPCs同其他的細胞嚴格區分的表面標志。目前將同時具有CD34、AC133、血管內皮細胞生長因子受體2三種表面標志的細胞稱為EPCs［9］。

2 EPCs與血管新生

EPCs是指在血管新生部位能夠分化形成功能血管的循環系統的內皮前體細胞。

血管新生包括兩種形式:一種稱為血管新生，由原先存在的血管內皮以出芽、分裂增殖等方式形成毛細血管叢，這一過程在實現由較大的血管網分支形成較小的血管叢在提供發育器官的血供方面起到十分重要的作用［10］;另一種稱為血管生成，由循環系統內或駐留在組織內的成血管細胞或EPCs形成新血管結構的過程。在胚胎發育期，血管的血管生成和血管新生同時產生作用，但出生后，人們一直認為血管的形成、維持和修復的機制是血管新生［11］。

1997年，Asahara等［3］在外周血CD34+細胞中分離出EPCs，進一步的研究發現在出生后骨髓來源EPCs能夠參與血管的新生，能夠在以前未存在血管的地方形成血管和血細胞，即出生后的血管發生，從而改變了以前對血管新生的認識。

3 EPCs與腫瘤生長

20世紀70年代初，Folkman［12］首先提出“腫瘤生長和轉移都依賴于新生血管的形成”。與胚胎發育期類似，血管的形成對于惡性腫瘤的發展起著決定性作用。大多數腫瘤組織起初以無血管的方式生長，直到其增殖和凋亡速率達到平衡，維持在封閉的休眠狀態。而腫瘤一旦從休眠期蘇醒，就變得高度依賴養料以生長達到一定大小。腫瘤細胞通過過度表達促血管生長因子，促進更多的異常血管生長的方式來克服缺氧的狀態［10］。

Lyden等［13］對獨特型基因突變型小鼠(Id-突變體小鼠)進行研究，這種小鼠因血管生成受損不能產生新的腫瘤血管而導致移植的腫瘤迅速縮小。將野生型小鼠骨髓移植到Id-突變體小鼠體內后將恢復小鼠的腫瘤血管生成能力，并促進腫瘤生長，這一研究首次證實骨髓來源的EPCs參與腫瘤血管生成。實驗發現，眾多腫瘤均可以利用EPCs形成新的血管［14］。

臨床研究顯示，在侵襲性腫瘤［15］和復發性腫瘤［16］患者外周血中頻繁檢測到EPCs的存在，提示EPCs參與腫瘤的發生。在一項對53例非小細胞肺癌患者的研究中發現，癌癥患者的循環EPCs量的基準水平顯著高于健康人。另外，還發現循環EPCs水平的增高與生存率的下降相關［17］。臨床相關性研究報道，循環系統中EPCs的增加與乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌患者的腫瘤分期及腫瘤大小呈正相關［15，18-19］。EPCs引起的血管新生的效應是由多方面因素決定的，如腫瘤的分期、位置以及類型［20］。有研究證據表明，在接受貝伐單抗治療的直腸癌的患者中，可將循環系統EPCs作為反映血管新生活動的預測指標［21］。循環系統的EPCs似乎伴隨著腫瘤活化信號的出現而同時出現［22］。現在對EPCs與腫瘤血管新生間關系的研究認為，在腫瘤的無血管期中，缺血組織由于缺氧誘導了EPCs的聚集［23］，EPCs在體內能定向歸巢于腫瘤，參與腫瘤新生血管的建立［24］。

4 EPCs與基因治療

基因治療載體大致可分為病毒型載體和非病毒載體。在過去的20年里，使用病毒載體和非病毒載體施行了1500多個基因治療的臨床試驗。然而，在大多數的例子中，治療的效果并不滿意，不良反應成為人們關注的主要問題［25］。

病毒型載體系統在體內外實驗中使用較多，主要有反轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體等，但病毒型載體缺點在于潛在的致癌性、自身免疫原性和(或)造成細胞病理改變等［26］。Ehlert等［27］在行腺相關病毒介導短發夾RNA的針對神經細胞基因治療中發現，當短發夾RNA在中樞神經系統高表達時，會引發不良反應導致神經退化。

非病毒載體系統所面臨的共同問題是外源基因轉移到宿主細胞后表達時間短，且基因表達關閉的機制尚不明確。

研究發現［28］，EPCs不表達主要組織相容性復合體，沒有免疫排斥作用，在體內能夠躲避自然殺傷細胞的殺傷作用，且其有靶向性高，系統毒性低的特點。臨床研究證實，EPCs能夠定向歸巢于腫瘤組織［18］，利用此特性可將其作為靶向運輸至腫瘤組織的基因載體［23］。由于EPCs具有維持成人血管完整性的生理功能，EPCs不僅可以定向聚集在腫瘤部位，同時也在缺血組織血管再生方面起到作用［29］。

4.1 EPCs與腫瘤的基因治療 2008年，王鈜等［30］將人干擾素γ基因經腺病毒轉導入EPCs，給荷瘤裸鼠靜脈注射攜帶干擾素γ基因的內皮祖細胞(endothelial progenitor cells carrying hIFN-γ，EPCs-hIFN-γ)，研究表明EPCs-hIFN-γ可以靶向性地分布到腫瘤局部，通過腫瘤局部分泌的干擾素抑制腫瘤的生長，延長荷瘤裸鼠的生存時間。

2010年，Hamanishi等［31］通過反轉錄病毒將鼠CC趨化因子配合基19(CC chemokine ligand 19，CCL19)基因導入胚胎內皮祖細胞(embryonic endothelial progenitor cells，eEPCs)，此基因表達后可產生一種淋巴細胞遷移趨化因子。在B6C3F1型小鼠皮下接種鼠卵巢癌HM-1型細胞，配合小鼠體內注入導入CCL19基因的eEPCs，研究結果顯示出免疫活性和腫瘤抑制效應。與對照組相比，eEPCs-CCL19組荷瘤小鼠體內腫瘤滲入更多的CD8+淋巴細胞，顯示出腫瘤抑制效應。在后續的研究中，該小組通過尾靜脈注入HM-1型細胞、B16黑素瘤細胞建立肺轉移癌模型，緊接著注入導入CCL19的EPCs而減少了肺轉移癌的數量并延長了小鼠的生存時間。在使用HM-1型細胞建立的腫瘤模型中，用此方法同樣可以觀察到抗腫瘤效應。這項研究結果顯示，使用EPCs傳遞系統免疫活化信號可改變腫瘤免疫微環境并起到治療作用，這對于多發的轉移的惡性腫瘤來說提供了一種新的治療策略。

王鈜等［32］在細胞毒性化療藥物作用后的裸鼠結腸癌移植瘤模型中給予EPCs-hIFN-γ，研究表明EPCs-hIFN-γ用于化療后維持治療可以抑制腫瘤細胞生長，延長荷瘤小鼠的生存期。上述實驗表明，EPCs可以靶向性的分布到腫瘤局部，可以作為免疫性基因載體在腫瘤治療領域進行進一步的研究。

Zhang等［33］將胸苷激酶基因修飾的EPCs注入帶有神經膠質瘤的裸鼠體內，配合更昔洛韋治療后，通過細胞凋亡及微血管密度的分析來評估其抗腫瘤效應。研究結果顯示，配合更昔洛韋治療后，胸苷激酶基因修飾的EPCs對神經膠質瘤細胞和人臍靜脈內皮細胞顯示出潛在的旁觀者效應。研究顯示，通過多次靜脈注入胸苷激酶基因修飾的EPCs可抑制血管生成而產生抗腫瘤效應。

2012年，Varma等［34］在人神經膠質瘤小鼠模型內利用EPCs作為載體于腫瘤部位基因表達人鈉碘同向轉運體，并通過單光子發射計算機斷層成像術檢測到了EPCs的遷移及人鈉碘同向轉運體基因的表達。研究表明EPCs能夠作為基因載體對神經膠質瘤進行基因治療。

4.2 EPCs與心血管的基因治療 2009年，Song等［35］將肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)導入EPCs，將HGF-EPCs注入高膽固醇血癥引起的動脈損傷小鼠模型，研究顯示HGF組小鼠體內靶向到達血管損傷部位的EPCs數量明顯高于未導入HGF基因的小鼠。更進一步研究表明，系統地采用HGF-EPCs可以更有效地減少新生血管內膜的形成，增加血管內皮新生。研究表明，EPCs作為基因載體是一種預防血管損傷后內膜形成的實用而有前途的治療方法。

Chen等［36］從豬外周血中分離培養EPCs，通過腺相關病毒將包含信號肽的成纖維細胞生長因子1(signal peptide-containing version of the FGF1，sp-FGF1)基因轉導入EPCs，在體外，轉導sp-FGF1基因的EPCs在遷移、管樣物形成及生存方面的能力增強。在動物心肌缺血模型中，經過4周的細胞移植治療，通過單光子發射計算機斷層成像術評估與對照組相比，轉導sp-FGF1基因組的動物在心肌灌注的缺損顯著減少，心肌缺血部位血管密度顯著增加。研究表明在慢性缺血模型中，基因改造后的EPCs血管生成能力比改造前得到提升，預示可用基于細胞的基因治療策略來治療缺血性疾病。2011年，Chen等［37］在豬模型中，通過腺病毒將血管內皮生長因子基因修飾到EPCs上，并種植到膀胱非細胞基質移植物，通過觀察微血管密度來判斷血管生長情況。研究發現，基因修飾組的模型的移植物血管密度顯著高于對照組。此項研究表明，在膀胱組織工程學方面，基因修飾血管內皮生長因子的EPCs可作為增加血供的良好手段。

5 小結

EPCs可以作為很好的組織工程及基因治療的載體，因為它們有良好的分型、廣泛的分化潛能以及有效的基因轉導能力［38］。EPCs不表達主要組織相容性復合體，沒有免疫排斥作用，能夠躲避自然殺傷細胞的殺傷作用，因此EPCs在腫瘤靶向生物治療中具有良好的運用前景。但在EPCs研究方面仍然存在問題需要克服，如EPCs在外周血中數量少，缺乏特異的分子標志，外周血EPCs是否可以替代生物標志物用作監測抗腫瘤、抗新生血管生成的藥物療效等。盡管一些關于EPCs的小規模、非隨機、非對照實驗已經出現，但是要深刻理解的生物學特性、評估這種新穎治療方法的安全性和臨床潛能以及加速基礎研究向臨床應用治療腫瘤方面的轉化還有很長的路要走［20］。相信，EPCs會成為腫瘤基因治療的一個有潛力的新靶點，為臨床治療腫瘤提供一條全新的途徑。

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