流式細胞術在腫瘤免疫學中的應用

河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所流式細胞室 劉 亮

流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)是70年代發展起來的一種快速對單細胞定量分析和分選的新技術，能定量分析細胞的生物化學成分。其檢測速度之快，統計學精度之高，是其他的方法無可比擬的，可同時從一個細胞中測得多種參數(如DNA、RNA、蛋白質、細胞體積等)進行多參數分析，為細胞生物學和生物醫學的研究提供了強有力的手段。80年代時，流式細胞術就已經廣泛應用于基礎和臨床醫學的研究，已成為切實可行有效的研究方法，同時在醫學領域中也得到了廣泛推廣應用，在免疫學、細胞遺傳學、腫瘤、病理學、放射生物學等學科，并形成了獨特的學科分支，諸如流式免疫學、流式遺傳學、流式病理學、流式細胞酶學等。

近年來，隨著流式細胞免疫學技術的迅速發展，流式細胞術與單克隆抗體技術結合，對細胞表面和細胞內抗原，癌基因蛋白及膜受體的定量檢測取得了很大進展，很多學者將流式免疫檢測技術用于臨床醫學，對疾病的診斷、治療、預后評價都起了重要作用。流式免疫技術克服了普通免疫學方法難以準確定量的不足，形成了流式免疫學獨特的科學分支，成為研究細胞免疫學的先進技術之一。隨著科學技術的發展，多種新的熒光探針的不斷出現，使 FCM技術的應用范圍不斷擴大，特別是各種各樣的熒光探針標記的單克隆抗體和其他蛋白質的出現，為 FCM 研究各種組織細胞膜和細胞內抗原、腫瘤性蛋白等開辟了新途徑，新的腫瘤標志物的出現，大大提高了FCM在醫學領域的研究水平，其發展速度之快，應用層出不窮。

腫瘤尤其是惡性腫瘤成為目前威脅人們生命健康的主要疾病，腫瘤的早期診斷及治療對于提高患者的預后及生存期具有重大的意義，腫瘤的早期缺乏典型的形態學表現，這樣就給常規的病理檢測，進行早期診斷帶來了困難。腫瘤標志物的出現給腫瘤早期診斷帶來了新的曙光。流式細胞術對于腫瘤標志物的檢測具有客觀、檢測速度快、操作簡便、數據精確等優點，適合于腫瘤標志物的檢測，有效提高腫瘤早期診斷的正確率。流式細胞術之所以能夠檢測腫瘤標志物，得益于流式細胞術與免疫學的結合形成的流式細胞免疫學。

流式免疫技術是研究以單細胞或單細胞核為基礎，并結合傳統的免疫學方法，其基本原理是細胞上的抗原與相關的單克隆抗體結合，形成帶有熒光的抗原抗體復合物，通過流式細胞術測定其特定熒光量。目前流式免疫學染色方法有直接免疫熒光標記法和間接免疫熒光標記法，推薦使用直接免疫熒光標記法，具有測定結果準確，操作簡便等優點。現就流式細胞術在腫瘤免疫學中的應用分述如下。

1 腫瘤基因蛋白產物的流式細胞術檢測

惡性腫瘤是一種多基因異常的疾病，它發生的分子基礎是原癌基因的激活和或抑癌基因的失活，導致某些細胞分化不良和增殖失控而形成腫瘤。目前研究發現，某些癌基因及抑癌基因蛋白可以作為腫瘤標志物用于腫瘤早期診斷。大量的與熒光素標記的癌基因及抑癌基因蛋白單克隆抗體的出現，也使得流式細胞術在腫瘤基因蛋白產物的檢測中得到了廣泛的應用。

癌基因是指一大類促進細胞分裂增殖，并具有潛在致癌或促癌作用的基因群，已發現的癌基因有：myc基因族，包括C-myc、N-myc、L-myc；ras基因族；fos、c-sis、c-abl、c-src、c-erbB-2等，抑癌基因則是一大類抑制細胞生長，對細胞增殖起負調節作用，并能潛在抑制癌作用的基因，包括DCC、NF-1、NF-2、RB、野生型p53、p16等，某些基因針對某種特定的組織或細胞才有意義，即各種組織來源的癌，應有它特定的癌基因譜或抑癌基因譜，也有組織特異的基因群。

c-erbB-2基因，又稱neu基因，該基因通過蛋白產物的過度表達而與參與人類腫瘤發生。有研究報道，c-erbB-2基因蛋白在乳腺癌中高表達，除此之外，它還與卵巢癌、宮頸癌、胃癌、唾液腺癌、食管癌及膀胱癌等多種腫瘤有關。突變型p53基因屬癌基因，它與結腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌和白血病等有關。Rb基因蛋白與視網膜母細胞瘤、成骨肉瘤、軟組織肉瘤、小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌等有關。

利用抗基因蛋白產物的單克隆抗體對基因蛋白的表達進行研究，流式細胞分析技術在腫瘤發生的分子機制研究方面有了很大進展，從分子水平極大的推動了對惡性腫瘤發生、發展的研究進展，并對腫瘤的診斷、預后檢測提供有用的標志物。

2 淋巴造血系統惡性腫瘤流式免疫表型分析

2.1 急性淋巴母細胞白血病免疫表型分析

急性淋巴母細胞白血病(ALL)的免疫學分類進展較快，其重點主要在于確定ALL的細胞來源和其成熟的階段。目前，對ALL尚無統一的分類標準，許多學者使用細胞特異性單克隆抗體輔以基因重排研究將ALL分為B細胞性、T細胞性和未分類ALL三種。流式細胞術對細胞上特異性表達的抗原進行檢測從而為ALL的分類提供診斷依據。

B細胞性ALL，CD19是ALL免疫表型分析最具價值的B細胞限制性單抗，是B細胞系統最早出現的特異性膜抗原，其出現早于CD10和CD20，且在漿細胞期以前持續存在。正常及惡性T細胞或髓性單核細胞無CD19表達。T-ALL的免疫表型可表現為胸腺細胞成熟過程的三個階段中任意階段的變化，不同階段有不同CD分子表達，但不管是處在哪一階段，幾乎均有CD7特異抗原的表達。現在已有不同熒光素標記的不同的CD的單克隆抗體，可以利用流式細胞術對其進行精確、快速的測量，為ALL的分類提供診斷依據。

2.2 惡性淋巴瘤的流式細胞術免疫表型分析

使用熒光素標記抗體的FCM細胞檢測已成為淋巴細胞免疫表型分析的一種有效方法。通過對淋巴細胞表面抗原進行連續性評價可弄清淋巴細胞分化過程各步驟抗原表達情況。據此可準確確定具有異常表型的淋巴細胞，這類淋巴細胞往往是惡性腫瘤細胞。一個單一表型淋巴細胞群體的檢出表明某一淋巴細胞亞群的單克隆性增生，這是惡性淋巴瘤的特征。何杰金淋巴瘤由于含有大量的非腫瘤成分，免疫表型的分析意義不太大，其研究工作多限于RS細胞的來源等方面，流式細胞術常用于非何杰金淋巴瘤免疫表型分析。如惡性淋巴瘤，小淋巴細胞型，典型者膜IgM和CD5、CD19、CD20、CD24以及HLA-DR抗原呈陽性表達；彌漫性惡性淋巴瘤，小核裂和混合細胞型，免疫表型常表現為CD19、CD20、CD22陽性，有時CD21和CD24陽性。但通常無CD10的表達。

隨著不同熒光染料標記的多種CD抗體的出現，流式細胞術已成為淋巴造血系統惡性腫瘤免疫表型分析的強有力的工具。

3 T淋巴細胞及其亞群免疫標記

T淋巴細胞是機體免疫系統功能最重要的一大細胞群，在免疫應答過程中，末梢血T細胞發育為功能不同的亞群，在正常機體內，各亞群的數量和功能發生異常時，就可能導致機體免疫紊亂并發生一系列的病理變化。

目前，越來越多的研究表明，T淋巴細胞亞群在各種臨床疾病(如造血系統疾病和惡性腫瘤等)都有異常改變，在各種疾病的發生、發展過程中用不同的T淋巴細胞表型標志物來測定人外周血中T抑制(T8)和T輔助(T4)淋巴細胞亞群比例T4/T8來評價體內細胞免疫調節平衡狀態，測定T亞群的相對標記率，可以幫助研究各種與免疫有關的疾病發病機制，特別是T細胞的免疫調節功能，所以，它可以作為臨床免疫研究的手段，成為臨床檢驗的一項重要指標。細胞免疫功能與惡性腫瘤的發生、發展及復發具有一定的關系，有研究發現，惡性腫瘤患者免疫功能低下，表現為T4細胞百分率降低，有甚者出現T4/T8比值倒置的現象，且在復發腫瘤患者中也檢測出細胞免疫功能低下的現象。目前已有較多的不同熒光素(FITC、PE、ECD等)標記的CD3、CD4、CD8等抗體，可以應用流式細胞術進行檢測，從而對免疫功能進行評價。隨著標準參考樣品在流式細胞術檢測中的使用，目前流式細胞術不僅可以檢測出CD3、CD4、CD8等陽性細胞占淋巴細胞中的百分率，而且可以檢測出T抑制(T8)和T輔助(T4)淋巴細胞亞群絕對數量，為患者免疫功能的評價提供更加精確的數據，指導患者臨床用藥。

4 血小板膜表面受體的標記

血小板是巨核細胞分化成熟后，巨核細胞質裂解脫落的小塊細胞質，它的最表層富含糖蛋白和一些酶，是血小板表面特異吸附的血漿成分，也是血小板黏著、聚集的反應部位，血小板膜上含有多種與凝血有關的因子，在止血、凝血、維持血管內皮的完整性方面具有重要的生理功能，血小板數量和機能的異常都可以引起釋放反應異常及反應無力癥，其反應異常表現為血小板對ADP、腎上腺素、膠原等誘聚劑的作用形成聚集后，不能釋放ADP及PFs等，如在血小板無力癥患者中血小板膜上的糖蛋白2b-3a復合物先天缺陷會導致其血小板聚集功能障礙。

目前認為，與血小板有關的血小板膜受體有2b、3a、2b-3a復合物，1b、VWF、GMP-140、Fg等，其檢測方法不盡相同，有SDA-PAGE法，交叉免疫電泳法，這種方法難于檢出較低含量的膜受體，而免疫印跡法的靈敏度雖較高，但標本用量大，操作復雜耗時長，膜純化過程中受體變化大，易丟失等原因，臨床實驗室較少應用，放免法易受其他細胞的干擾或一個抗原分子結合多個抗體而導致測定結果偏高等缺點，而流式細胞術檢測血小板膜受體，是分析血小板方法學上的重要進展，它從分子水平診斷血小板功能和數量的異常，方法操作簡便、快速、特異和準確度高，重復性好，且標本的用量少，能靈敏地從大量血小板中檢出2%受體陽性或陰性的血小板。因此，流式細胞術測定血小板膜受體數量和功能很適合作為臨床檢驗。

近年來，隨著流式細胞術相關技術的不斷發展，尤其是熒光素標記的新型抗體的不斷問世，使得流式細胞術在腫瘤免疫學中得到了廣泛的應用，對于腫瘤的早期診斷、判斷預后、監測治療效果等方面具有重要的意義。流式細胞術在生物醫學中將具有廣泛的應用前景。