微電子細胞傳感器在抗腫瘤藥物分析中的應用研究*

鄭 波，劉清君，曾 蘇

(1.浙江大學藥學院藥物分析與代謝研究室，浙江 杭州310058;2.浙江大學生物醫學工程與儀器科學學院生物傳感器國家專業實驗室，浙江杭州310027)

0 引言

惡性腫瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病，其發病率近年來一直都處于逐年上升的趨勢。目前，化學藥物治療仍是腫瘤的重要治療手段。因此，如何研發出能夠有效抑制癌細胞生長增殖，或對其直接具有殺傷性作用的預防或治療性藥物是腫瘤防治的重要環節。隨著醫藥技術的快速發展，體外培養的腫瘤細胞系為抗腫瘤藥物的篩選與藥效評價提供了一個有效的生物學方法。通過細胞的形態學觀察與分子生物學實驗能夠以此獲得藥物對細胞的直接作用效果，并最終通過對培養細胞生長的抑制率差別，進行藥物的篩選與評價。

近年來興起了采用微納米電子傳感器芯片對細胞或組織進行直接測量的研究［1］。基于細胞電阻抗傳感測試的ECIS(electrical cell-substrate impedance sensor)技術，便是一種能夠同時測量多組不同細胞的電阻變化、膜電容變化，以及細胞層—基底膜空間變化的細胞生理與病理研究的細胞傳感器(cell-based biosensor)技術［2，3］。通過 μA 級的電流測量，可以實時連續地量化研究細胞外基質與細胞增殖之間的相互作用，測量貼壁細胞遷移過程中細胞形態變化。相對于普通光學顯微鏡和熒光標記觀察等傳統方法而言，這種細胞傳感器的阻抗測試使得細胞形態研究更為直觀和方便，并容易獲得實時定量的測試結果，從而已成為藥物高通量篩選研究的有效平臺［4，5］。

本研究在對細胞與電極界面阻抗檢測理論分析的基礎上，采用微納米電子技術制備了以交錯方式間隔排列的叉指電極陣列(interdigital electrode arrays)傳感器芯片，搭建了阻抗測試分析系統，以人參皂苷Rh2等抗癌藥物對人肺腺癌A549細胞模型的作用研究為例，建立了能對抗腫瘤藥物進行實時、無損分析的細胞傳感測試技術平臺。

1 微電子傳感器原理

將細胞培養在一個或多個電極上，有效的電極阻抗變化能夠對培養細胞的黏附、伸展，以及遷移性進行無損檢測。圖1是阻抗細胞傳感器的示意圖，該系統可用于實時定量地檢測貼壁培養的哺乳細胞的黏附和伸展生長過程。該技術最早由曾獲得諾貝爾物理學獎的Giaever I和他的同事Keese C R在美國General Electric(GE)公司工作時發明［2，3］。他們采用哺乳動物細胞，用Au電極(2 cm2對電極和3×10－4cm2工作電極)表面進行了細胞培養。用一個帶有函數發生器的鎖相放大器和一個相位敏感探測器搭建測試電路，并用電阻限制電流約為1mA，在4kHz正弦波小信號下測量細胞與基底間的阻抗，即ECIS。采用交流阻抗方法使得金屬微電極表面通過μA級的電流時，原來可以直接流經電極表面的電極電流，由于被培養生長在其表面的細胞所覆蓋，而最終只能從細胞側面通過電阻間隙區域流過。

ECIS系統的電極都是采用面積較小的微電極作為工作電極進行阻抗測量。小電極的缺點是細胞不容易分布在電極上，需要接種較大密度的細胞，以確保細胞能附著在電極表面，并且，小電極測量到的阻抗值只能反映一小部分細胞的狀態，容易造成不同實驗組別之間的差異。針對這些問題，基于叉指電極(interdigitated electrodes，IDEs)的細胞阻抗測量方法開始作為集成細胞培養系統，用于細胞動力學的檢測。叉指電極能覆蓋傳感測試腔基底大部分的面積，因此，大大增加了有效測量細胞數目，產生有效阻抗。同時叉指電極也便于微型化，為其在藥物或毒素的高通量應用奠定了基礎［4，6］。

圖1 細胞在電極界面的阻抗分析示意圖Fig 1 Impedance analysis diagram on the electrode interface of cell

2 電極界面阻抗分析

電化學阻抗譜方法是一種常用的以小振幅的正弦波電位(或電流)為擾動信號的電化學測量方法，是一種頻率域的測量方法，以測量得到的頻率范圍很寬的阻抗譜來研究電極系統，因而能比其他常規的電化學方法獲得更多的動力學信息和電極界面的結構信息。因此，在微電極阻抗測試過程中，當對微電極施加電場時可以測量到一個基線阻抗，其主要是由電極和周邊的離子環境決定。電極電解液界面的雙電層結構相當于一個電容器，當電極電位改變時，雙電層電容器即充電或放電。

當具有貼壁性能的腫瘤細胞貼附在電極之上時，測量電極間阻抗可提供關于電極上細胞活性狀態的重要信息。當細胞生物狀態發生變化時，系統可以實時并自動獲取其模擬電信號，并最終轉換成數字信號以進行進一步的分析［4］。如圖1所示，測量所得的總阻抗包括了電極阻抗Ze，細胞與電極鈍化層之間的溶液封接阻抗Rseal，以及細胞膜電容Cm1和細胞膜離子通道阻抗Rm1。其實，封接阻抗Rseal主要產生于電極上細胞膜所覆蓋部分的電容和電導，所以，影響交流阻抗的最主要因素也就是封接阻抗Rseal，并且主要反映了細胞的生長狀態與特性。

3 傳感器芯片與系統

叉指電極陣列是由許多相互獨立的叉指電極單元分別與兩端的電極引線共同構成兩對互相交錯的叉指電極區域，相鄰電極之間由絕緣材料相間隔［6］。電極芯片的加工，是在中國科學院上海微系統所，基于標準光刻技術的微加工工藝所完成。在硅基底濺射Cr薄膜約30 nm的基礎上，磁控濺射約350 nm厚的Au膜作為電極材料。采用光刻、濕法腐蝕、等離子增強化學氣相淀積等方法，最終獲得叉指電極型生物電阻抗檢測傳感器芯片如圖2所示。其各通道是12對直徑為50μm的微電極，以交錯的方式間隔50μm排列。最后，用環氧樹脂將底部帶孔的塑料培養腔黏貼在PCB板上，暴露出叉指電極陣列表面，作為細胞培養與測試的腔體結構，并最終配以相應的藥物微進樣與控制系統。

圖2 細胞阻抗測量系統的叉指電極Fig 2 Interdigitated electrodes of the cell impedance measurement system

細胞檢測時，傳感芯片通過導線與放在細胞培養箱外面的Zanium電化學工作站(德國Zahner公司)相連，并與電腦通信以實現數據自動采集。通過施加到芯片電極上的交流激勵，該電化學工作站能夠在10μHz～4MHz頻率范圍內測量阻抗的幅值與相位變化，也能在固定頻率下測量阻抗幅值和相位隨時間的變化。進行阻抗測量時采用兩電極體系，即分別與叉指電極兩端連接的工作電極和連接在一起的對電極與參比電極。

4 藥物抗腫瘤作用分析

在細胞實驗中，將人肺腺癌細胞系A549細胞(浙江省中醫院腫瘤科提供)，接種于芯片叉指電極表面進行傳代培養。具體的細胞固定培養過程，嚴格按照細胞系常規無菌培養方法進行，并在顯微鏡下觀察，細胞長滿電極表面后進行藥物分析測試實驗。在整個過程中，芯片置于在5%CO2和37℃的培養箱環境中。

既往的抗腫瘤藥物研究發現，天然藥物人參的主要有效成分人參皂苷Rh2，對肺癌細胞的體內外生長具有顯著的抑制作用。本研究中，選用人參皂苷Rh2作為代表性藥物(浙江亞克藥業有限公司提供的人參皂苷Rh2標準品)，在1 kHz固定頻率下對3個獨立通道的芯片阻抗進行同時監測，并用顯微鏡觀察電極上細胞貼附和生長情況作為對照。圖3是芯片在不同濃度藥物(5，10，20μmol/L)刺激前后的阻抗變化，從中可以明顯看出在加入藥物后，阻抗大幅度地持續下降，尤其在藥物加入50～150 min內下降最明顯，一方面驗證了測試系統的高效性，也得到了藥物對細胞作用的時間依賴性結果。圖4是通過顯微鏡觀察的肺腺癌細胞在人參皂苷Rh2加入前后細胞的黏附情況和細胞形態。在藥物作用前，可見大量圓形泡狀肺腺癌細胞電極表面有貼附生長，細胞在電極表面有序排列，細胞與細胞間連接精密，細胞生產繁殖良好，視野可見大量細胞。在藥物刺激以后，所見細胞數明顯減少，所剩細胞幾乎都從電極表面脫落，在電極間可見大量死亡細胞碎片和一些開始變型的細胞，這是細胞開始死亡的形態改變之一。

圖3 抗腫瘤藥物測試結果Fig 3 Test results of the anti-cancer drugs

圖4 電極表面的細胞觀察Fig 4 Cells observe on the electrodes

由于不同通道藥物加入前的細胞的貼附情況不同，3個通道阻抗改變的程度也不同。比較3個通道的變化，通道1在200Ω左右趨于穩定，通道3到150Ω趨于穩定，說明試劑對細胞的作用有一定的濃度依賴性。對通道1阻抗曲線進行分析，在加入藥物后阻抗就開始下降，在藥物刺激的前幾分鐘，下降的速度較慢，在經過一段時間作用之后趨于穩定。推測這種阻抗改變規律與藥物的作用機制有一定關系。結合已發表的人參皂苷Rh2對肺腺癌A549細胞作用機制的探究，人參皂苷Rh2可以誘導癌細胞凋亡，增加機體的免疫力，逆轉腫瘤細胞的耐藥性，當其與順鉑聯用時，效果明顯高于單獨使用時對肺腺癌A549細胞的抑制率，并有一定的濃度依賴性。

隨著信息技術與生物醫藥技術的不斷結合，計算與系統生物學研究目標是通過運用計算生物學的方法，研究細胞、組織和生物整體不同水平上的各種分子及其相互作用。該研究同生物傳感器技術，尤其是能夠整體輸出功能信息的細胞傳感器技術結合，可以有效地揭示藥物作用于癌細胞的作用機理。本文利用計算機輔助藥物設計中的分子對接和藥效團模型技術，對 Bcl—2，caspase—3，Fas，P53 等細胞凋亡相關蛋白與Rh2的細胞凋亡途徑進行了研究［7］。如圖5所示，是采用Surflex-dock系統進行分子對接后的Bcl-2蛋白的藥效團模型構建結果。從生物計算的角度對傳感器的結果進行了驗證，并預示了將二者有效結合，用于抗腫瘤藥物分析的可行性。同時，結合本次實驗所得結果，其與用MTT比色法、流式細胞術，以及雙抗體夾心ELISA(酶聯免疫吸附劑測定)進行生物指標測定得到實驗結果一致，而且其反應濃度更低。結果顯示，細胞芯片阻抗測定的靈敏度更高，并具有良好的濃度依賴性和時間依賴性。

圖5 細胞凋亡相關蛋白Bcl—2與Rh2的藥效團分析結果Fig 5 Analysis results of the main target spot of the Rh2 to apoptosis-related proteins Bcl—2

5 結束語

從目前的細胞傳感器技術來看，細胞微電子傳感器平臺能夠為腫瘤細胞在不同藥物干預下的作用提供一個便捷的檢測技術手段，能夠對固定培養于其表面的細胞的生理病理特性，如細胞生長、伸展、形態變化、死亡和貼壁程度，及其與細胞外基質分子的相互作用進行良好的評價。所有這些細胞特性的改變，都與腫瘤的發生發展極具密切關系。尤其是，如果進一步將腫瘤患者手術切除的癌組織標本收集分離得到的腫瘤細胞，經體外給藥培養，通過傳感器觀察藥物對細胞的直接殺傷作用，便可以根據化療藥物系列濃度對培養細胞生長的抑制率差別，最終建立起一套能在臨床化療前為患者篩選敏感性藥物的檢測技術。最終客觀地針對不同個體，選擇和優化化療藥物及其組合。

［1］王 平，劉清君.生物醫學傳感與檢測［M］.杭州:浙江大學出版社，2010.

［2］Giaever I，Keese CR.Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field［C］∥Proc of Nat’l Acad Sci of USA，1984:3761－3764.

［3］Giaever I，Keese C R.A morphological biosensor for mammalian cells［J］.Nature，1993，366:591－592.

［4］Asphahani F，Zhang M.Cellular impedance biosensors for drug screening and toxin detection［J］.Analyst，2007，132:835－841.

［5］胡朝穎，劉清君，張遠帆，等.基于叉指電極的細胞阻抗傳感器研究［J］.傳感技術學報，2010，23:291－296.

［6］Liu Q，Yu J，Xiao L，et al.，Impedance studies of bio-behavior and chemosensitivity of cancer cells by micro-electrode arrays［J］.Biosen Bioelectron，2009，24:1305－1310.

［7］Van M F，Huang D C S.How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis［J］.Cell Res，2006，16:203－213.