天門市特殊教育學校聾啞學生耳聾相關基因檢測結果分析＊

何本超 徐碧生 李健勇 顏風波 鄭志剛 蔣玉歡 鮑柏林 鄢烈雄

1 湖北省天門市第一人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科（天門 431700）

2006年第二次全國殘疾人抽樣調查顯示，我國現有聽力障礙者2 780萬人，占全國8 296萬殘疾人的33.5%，居各類殘疾之首［1］。在我國，每年新增聽力及言語障礙者近8萬人，新增聾兒近3萬人，其中50%是由遺傳缺陷引起的，可見，遺傳因素是導致耳聾的重要因素［2］。減少耳聾的發生重在早期預防與干預，而明確其遺傳學病因是關鍵。在不同地區和不同人群中耳聾基因的突變頻率、突變方式和熱點突變有很大的差異，為了解天門市特殊教育學校耳聾人群的常見分子遺傳病因學特點，2012年3月對天門市特殊教育學校52名聾啞學生進行GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體 DNA12SrRNA 4個基因的9個熱點突變進行檢測，報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象為湖北省天門市特殊教育學校的52名聾啞學生，原籍均為天門市，均為漢族。其中，男28例，女24例，男女比例為1.17：1；年齡5～16歲，平均11.08±3.08歲。

1.2 研究方法

1.2.1 病史資料采集及體檢 病史資料采集得到研究對象及其家長的同意并簽署知情同意書。調查內容包括：①一般情況：登記時間、接診醫生、姓名、性別、年齡、民族、籍貫、出生年月、居住地址、聯系電話、父母親及其聽力情況。②耳聾的發病時間、發病原因、耳聾以前是否會說話、耳聾病情進展及伴隨癥狀。③母親妊娠期情況：傳染病史、耳毒性藥物應用史、生產情況；④個人史：聾前患病史、全身系統疾病、頭部外傷史、環境噪聲史、家庭史和耳毒性藥物應用史。對所有研究對象進行耳部、視力及視野、虹膜、鞏膜、甲狀腺、毛發及其他體檢；進行純音測聽、聲導抗、ABR、40HzAERP、DPOAE、ECochG、ASSR等聽力檢測。

1.2.2 DNA提取 取受試者外周血3～5ml保存在4℃條件下，避免震蕩，1天內送到湖北省人民醫院，應用耳聾基因芯片（北京博奧生物有限公司）進行 GJB2（35delG、176del16、235delC 及 299delAT）、GJB3（538C＞T）、SLC26A4（2168A＞G、IVS7－2A＞G）以及線粒體DNA12SrRNA（1494C＞T、1555A＞G）常見致聾基因突變熱點篩查 ，按試劑盒說明書進行操作。每份標本提取兩份DNA，分別儲存，除工作液外均保存在－80℃深低溫冰箱。

1.2.3 PCR反應 將針對9個突變位點的9組引物分成A和B兩個反應體系分別進行多重PCR，在每個20μl反應體系中加入待測全血基因組DNA（濃度100～200ng／μl）3μl、擴增引物混合物12.5μl、擴增試劑混合物4.5μl。PCR反應程序：37℃10min，95℃15min，96℃1min預變性，94℃30 s、55℃30s、72℃45s共32個循環，70℃45s、60℃10min。在擴增過程中，設置參數使溫度以0.4℃／s的速度從94℃降溫至55℃，以0.2℃／s的速度從55℃升溫至70℃。

1.2.4 雜交 PCR產物加熱至95℃變性10min后混合物中冰浴3min。從同一個樣品模板的兩個不同擴增體系管（A、B）中各取2.5μl PCR產物加到10μl雜交緩沖液管中。將14μl雜交混合液加到芯片的微陣列區域，加雜交盒上蓋，封閉雜交盒后放入50℃雜交儀中1h。

1.2.5 顳骨CT檢查 對檢測出的SLC26A4基因突變攜帶者進行16排螺旋CT顳骨掃描。正常者前庭導水管外口與總腳或峽部中點直徑平均1.9 mm，最小1.6mm，最大2.3mm；根據1978年Valvassor提出的診斷標準，前庭導水管外口與總腳或峽部中點直徑＞1.5mm為擴大。

2 結果

2.1 52名聾啞學生均為非綜合征型聾，按照WHO（1997年）的聽力損失程度分級標準，均為重度和極重度感音神經性聾。

2.2 52例耳聾者中，共發現攜帶與遺傳性聾相關基因突變者25例（48.08%，25／52），其中SLC26A4基因突變攜帶者9例（17.30%，9／52）、GJB2基因突變攜帶者12例（23.08%，12／52）、mtDNAl2SrRNA線粒體基因突變攜帶者4例（7.69%，4／52），未發現GJB3基因突變攜帶者（表1）；其中2例GJB2 35 delG合并IVS7－2A＞G基因的雜合突變，2例SLC26A4 2168A＞G合并IVS7－2A＞G基因的雜合突變。GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者占基因突變總例數的84.0%（21／25）。對9例SLC26A4基因突變攜帶者行顳部CT掃描，9例均顯示前庭水管擴大（17.31%，9／52），這9例耳聾基因芯片檢測結果分別是IVS7－2A＞G純合突變1例，IVS7—2A＞G雜合突變6例，SLC26A4 35delG合并IVS7－2A＞G基因的雜合突變2例。

3 討論

遺傳性聾的遺傳背景復雜，臨床表現多變，目前尚無有效藥物治療，大部分患者只能依靠配戴助聽器或植入人工耳蝸等輔助手段進行康復治療，因此，對此類疾病的早發現、早診斷、早治療，對于患者早日融入有聲社會具有重要意義。

表1 52例受檢者4種耳聾相關基因的突變檢測結果（例）

國人中最常見的GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRNA3種耳聾相關基因均有突變熱點。GJB2基因定位于人染色體13q11－12，全長4 804 bp，mRNA長2 3ll bp，編碼區678bp，含2個外顯子，編碼B－2型縫隙連接蛋白（Cx26）是鉀離子循環通路的一部分，對于耳蝸正常滲透壓及聽敏度的維持起著極其重要作用。GJB2基因的編碼區發生突變可以產生無功能的縫隙連接蛋白，降低縫隙連接的通透性，影響通道的正常開閉，使鉀離子回流入內淋巴液的循環障礙，導致Corti器的鉀中毒，從而導致感音神經性聾（seosorineural hearing loss，SNHL）［3］。目前已報道的GJB2基因突變類型有150多種，突變方式包括移碼突變、錯義突變、無義突變及剪接位點突變等，其中多數患者表現為常染色體隱性遺傳，大部分表現為先天性聾或語前聾。本研究對象中GJB2基因突變攜帶者12例（23.08%，12／52），與解放軍總醫院全國聾病分子流行病學調查結果（21.05%）［4］一致。

SLC26A4（solute cartier family 26，member 4 protein）即PDS基因，定位于7q31，全長為57 175 bp，編碼區為2 34 3bp，由21個外顯子組成，其中20外顯子編碼氯－碘離子轉運蛋白Pendrin，780個氨基酸，主要表達于甲狀腺、內耳、腎臟。解放軍總醫院報告SLC26A4基因突變率21%［5］；席宏等［6］報告61例非綜合征性聾患者SLC26A4基因突變率為16%。本組研究對象中SLC26A4基因突變率17.30%（9／52），與上述報道相近。分析其原因可能為：不同年齡段SLC26A4基因突變檢出率是不同的，有文獻報告［7］，在發病和就診年齡為0～10歲的耳聾群體中，SLC26A4基因突變的檢出率均為最高（分別為34.32%和34.52%），而在較大年齡段，SLC26A4基因突變的檢出率要低一些。本組研究對象平均年齡11.08歲，且因樣本量有限，結果有一定的局限性。文獻報道大前庭水管綜合征（1arge vestibular aqueduct syndrome，LVAS）的發病與SLC26A4基因突變具有直接的因果關系，從文中結果可見，9例SLC26A4基因突變病例的顳骨CT掃描均顯示前庭水管擴大，可見，對LVAS病例進行SLC26A4基因檢測，有利于從分子水平明確病因，早期診斷，早期治療。

目前大量研究已證實mtDNA突變與氨基糖苷類藥物導致的耳聾密切相關，部分患者對氨基糖苷類藥物有易感性，微量的藥物就可以造成聽力損失。一部分12SrRNA基因A1555G突變患者即使不接觸氨基苷類藥物，同樣會發生感音神經性聾［9］。本組患者中與藥物性聾相關的線粒體12SrRNA基因突變攜帶者4例（7.68%，4／52），其中2例母親妊娠期注射過丁胺卡那霉素，另2例用藥史不詳；4例中線粒體DNA 12SrRNA基因A1555G點突變率3.85%，高于文獻報道的3.43%［10］。

既往有研究報告GJB3基因突變攜帶率0.56%（1／177）［8］，本組研究對象中未發現 GJB3基因突變者，其原因可能與樣本量偏少有關，并不能確認天門市耳聾人群中沒有該基因突變者存在。因此，有待于擴大樣本量進一步研究。

從本研究結果看，SLC26A4基因突變患者多數有殘余聽力，對這類患者應囑避免各種外傷、感冒或耳毒性藥物的使用，避免加重耳聾的誘因及注意預防甲狀腺腫的發生［11］，植入人工耳蝸效果良好；GJB2基因突變者，應告之在婚前需行耳聾基因檢測，避免雙方為同型遺傳性聾者婚配，預防聾兒出生；與藥物性聾相關的rtDNA12SrRNA線粒體基因突變攜帶者，應告知禁用耳毒性藥物，尤其是其母系成員更應禁用耳毒性藥物，避免或減少親代及子代發生遺傳性聾，對于已由耳毒性藥物導致的聽力損失患者，植入人工耳蝸有效。

1 孫喜斌，魏志云，于麗玫，等.中國聽力殘疾人群現狀及致殘原因分析［J］.中華流行病學雜志，2008，29：643.

2 陳金霞，張桂茹.吉林省非綜合征性耳聾分子病因學分析一線粒體DNA 12SRrRNAAl555G位點突變基因篩查［J］.中國實驗診斷學，2007，11：287.

3 于飛，戴樸，韓東一.GJB2基因突變及語前遺傳性非綜合征性耳聾［J］.國外醫學耳鼻咽喉科學分冊，2005，29：359.

4 于飛，韓東一，戴樸，等.190例非綜合征耳聾患者GJB2基因突變序列分析［J］.中華醫學雜志，2007，87：4.

5 戴樸，韓東一，曹菊陽，等.家族性大前庭水管患者的PDS基因型分析［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2006，20：147.

6 席宏，張芩娜.大前庭水管綜合征SLC26A4基因突變分析［J］.中國藥物與臨床，2011，11：394.

7 王建國，袁永一，韓冰，等.不同年齡的重度耳聾患者常見耳聾基因突變的陽性率分析［J］.中華耳科學雜志，2010，8：396.

8 梁爽，孫喜斌，韓睿 ，等.非綜合征型聾患者耳聾相關基因檢測結果分析［J］.聽力學及言語疾病雜志，2011，19：10.

9 Matsunaga T，Kumanomido H，Shiroma M，et a1.Deafness due to A1555Gmitochondrial mutation without use of aminoglycoside［J］.Laryngoscope，2004，114：1 085.

10 劉新，戴樸，黃德亮，等.線粒體DNA A1555G突變大規模篩查及其預防意義探討［J］.中華醫學雜志，2006，86：1 318.

11 Scott DA，Wang R，Kreman TM，et a1.The Pendred syndrome gene encodes a chloride－iodide transport protein［J］.Nature Genet，1999，21：440.