精子質量綜合評估指標的建立*

趙洪鑫 王 會 武俊青 袁 瑤 吳曉蕓 施惠娟△

常規精液檢查是評估男性生育力的重要手段，主要包括精液量、pH值、精子密度、動力學參數、形態學參數等指標〔1〕。每個獨立的精液檢測指標都不能全面地評價男性的生育力狀況，臨床上往往綜合參考多個指標。但指標太多對臨床醫生的診斷增加了困難。為簡化臨床診斷，武俊青等〔2〕曾對精液檢查的結果進行主成分分析來綜合評價精液質量。但僅依靠常規精液檢查仍難以有效指導男性不育的診斷，更不足以在輔助生殖技術中準確評估精子功能，因此需要更多更好的精子功能檢測來系統評估男性生育力〔3〕。研究表明，用熒光復合染色法檢測存活精子率(live/dead sperm viability)能夠評估精子質膜完整性〔4〕。與伊紅染色，精子低滲腫脹實驗(hypo-osmotic swelling test，HOST)相比，熒光復合染色法能更有效地反映精液中死活精子的比例，在輔助生殖技術的實驗室診斷中更有應用價值。精液中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)主要由精液中的白細胞和畸形精子產生，與精子DNA損傷密切相關，是一個能夠反映精子受精能力的獨立指標〔5〕。本實驗室用熒光染色法對臨床精液標本進行了精子質膜完整性的檢測〔6〕，并首次報告了用化學發光法檢測的中國男性不育人群精液ROS水平〔7〕。在前期大樣本研究的基礎上，本文擬對精液樣本的檢測結果進行主成分分析和多變量線性組合，探討建立精子質量綜合評價指標的可行性。

資料與方法

1.研究對象

273名2007年因不育癥在上海計生所醫院進行精液檢查的男性，納入標準:同居兩年以上未避孕，性生活正常而未育。排除標準:臨床診斷為女性因素導致的不育;無精子癥;精液不液化。同期納入35名已婚育的志愿者。納入標準:已育男性。排除標準:最近一次生育時間超過5年。作為建立綜合指標的數據來源。

另選取100名2009年因不育癥在上海計生所醫院進行精液檢查的男性。同期納入30名已育志愿者。納入標準同上。用以對建立的綜合指標進行預測評估分析。

2.常規精液檢查

根據WHO標準〔8〕收集精液。待精液完全液化后使用CASA系統(Cyto-S;Alpha Innotech Corp)檢測以下指標:

(1)精子密度(×106/mL)

(2)活動率(活動精子百分比)

(3)曲線速率(curvilinear velocity，VCL;μm/s)

(4)直線速率(straight-line velocity，VSL;μm/s)

(5)平均路徑速率(average path velocity，VAP;μm/s)

(6)直線性(linearity，LIN;%)

(7)頭部搖擺頻率(amplitude of lateral head displacement，ALH;μm)

3.精子形態學檢查

根據WHO標準〔8〕，采用Diff-Quik染色法評價精子形態學指標。計算正常形態精子率(sperm morphology)。

4.用熒光復染法檢測精子質膜完整性

用Live/Dead Sperm Viability Kit(L-7011;Invitrogen)檢測精子質膜完整性，計算存活精子率(viability):

5.用化學發光法檢測精液ROS水平

將400 μL完全液化后的精液加入一次性照度計容器內。取4 μL魯米諾儲存液(25 μM于二甲亞砜)，同時加入8 μL辣根過氧化物酶(12.4 U的Ⅵ型辣根過氧化物酶，310 U/mg)。使用Berthold照度計檢測化學發光信號約5 min，直至其達到穩定。發光信號測量單位為相對化學發光強度(RLU/s)。

6.統計分析方法

精液各指標檢測結果采用描述性統計分析，兩組間的比較用Wilcoxon秩和檢驗;指標之間的關系采用Spearman相關分析;對精液主要指標進行主成分分析;在各精液指標和ROS水平值中設定不同的分界點以預測男性不育，繪制受試者工作特征曲線(receive operating characteristic curve，ROC)，計算曲線下面積并進行分析。統計分析采用SAS 9.2軟件包;ROC曲線的繪制和分析采用Medcalc 9.6軟件。

結 果

1.一般情況和精液檢查結果

2007年的不育患者年齡為(30.97±5.13)歲，不育年限為(4.31±2.77)年。已育志愿者，年齡為(33.15±4.46)歲。精液檢測結果見表1，由于各指標均不呈正態分布，因此用中位數、25和75百分位數描述。

表1 已育志愿者和不育患者精液主要指標檢測結果(Median(P25，P75))

2.精液參數之間的相互關系

對273例不育男性的精液參數進行Spearman等級相關分析，除ROS外的其他精液參數之間均呈正相關，精子動力學參數之間(活動精子率、VCL、VSL、VAP、LIN、ALH)有較強的正相關。精子密度和精子動力學參數、形態學參數呈中等程度的正相關。而存活精子率與活動精子率僅有中等程度的正相關。ROS除與精子形態有較弱的負相關外，與其他精液參數均無顯著相關性，結果見表2。

表2 重要精液指標spearman相關系數矩陣

3.主成分分析結果

由于ROS與其余的精液參數無顯著相關，是一個相對獨立的指標，因此對其余9個指標進行主成分分析。

進行主成分分析之前需將原始變量進行標準化變換。本研究中有4個指標是百分率，因此采用對數轉換的方法進行標化:將9個指標——精子密度、活動精子率、VCL、VSL、VAP、LIN、ALH、正常形態精子率、存活精子率加1后取以10為底的對數。標化的目的在于:減少過偏數值的影響;消除不同指標由于各自量綱不同帶來的影響;減小由數量級差異帶來的影響，如×106和 ×104。

各主成分的特征根、貢獻率和累計貢獻率見表3。

表3 主成分分析的結果

第一個主成分解釋了總變異的71.46%，第二個主成分解釋了總變異的9.49%。前2個主成分解釋了超過80%的總變異，因此取前兩個主成分就基本上反映了原資料的信息。

第一、第二主成分按照下式計算:

Prin1=0.259155×lg(精子密度+1)+0.369788×lg(活動精子率 +1)+0.387720×lg(VCL+1)+0.384482×lg(VSL+1)+0.391107×lg(VAP+1)+0.360037×lg(LIN+1)+0.373514×lg(ALH+1)+0.195413×lg(存活精子率+1)+0.194042×lg(正常形態精子率+1)

Prin2=－0.425385×lg(精子密度+1)－0.174125×lg(活動精子率 +1)－0.112581×lg(VCL+1)+0.029970×lg(VSL+1)－0.014354×lg(VAP+1)+0.162610×lg(LIN+1)－0.153000×lg(ALH+1)+0.805555×lg(存活詳精率+1)+0.276007×lg(正常形態精子率+1)

由上式可知，第一主成分各分量的大小大致相當，說明第一主成分是一個綜合指標，全部系數為正，因此第一主成分代表了精液的綜合質量;第二主成分在活精子率上有較大的系數，在精子密度上系數也較大且為負，說明第二主成分高的精液其精子質膜完整性較高但密度較低，因此第二主成分代表了精子在體外存活的狀態。因此，在臨床預測自然受孕時第一主成分更有意義，而第二主成分可能在輔助生殖技術中有潛在應用價值。

為方便臨床診斷，取第一主成分來評價精液綜合質量，在已育志愿者中，Prin1的均值為4.6253513，標準差為0.2470433。對Prin1進行標準化處理并命名為精液質量得分(semen quality score，SQ)，使已育志愿者組SQ的均值為100，標準差為10，即SQ＞110為高質量精液，SQ＜90為低質量精液，計算原理和方法與智商(IQ)類似:

4.多變量線性組合建立綜合診斷指標

對于擁有CASA系統并能檢測存活精子率的男科學實驗室，可以采用SQ來評估男性生育能力，而有條件檢測精液ROS水平的實驗室，可以進一步用SQ和ROS兩個指標聯合預測男性不育。

下面以logistic回歸為基礎，采用多變量線性組合的方法〔9，10〕將SQ得分和ROS水平同時應用，建立聯合預測因子。

以是否不育為應變量，SQ和lg(ROS+1)為自變量，擬合logistic回歸模型，由于ROC資料中疾病狀態為二項分布，logit連接函數參數是OR(odds ratio)的對數，較容易解釋模型中參數變化的含義，故選用logit連接函數。

模型中各參數如表4所示。擬合結果用下式表示:

表4 logistic回歸模型擬合結果(n=308)

對logistic回歸方程進行變換得到預測因子Lβ(Y):

得到聯合預測因子的表達式:

5.ROC曲線分析結果

在273例不育男性和35例已育志愿者中，根據上面得到的公式計算每份精液的SQ值和SQ+ROS聯合診斷指標值，并比較傳統的精液指標(精子密度、活動精子率、正常形態精子率)和SQ得分診斷男性不育的ROC曲線，如圖1。而以SQ、ROS及SQ+ROS聯合指標診斷不育的ROC曲線見圖2。

圖1 不同精液參數診斷男性不育的ROC曲線

圖2 SQ和精液ROS水平診斷男性不育的ROC曲線

用各精液參數診斷男性不育的ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)見表5。SQ的ROC曲線下面積大于其余所有單個指標。而SQ-ROS聯合預測因子的ROC曲線下面積在所有指標中最大。

表5 不同精液參數診斷男性不育的ROC曲線下面積

6.最佳參考值的確定

在進行ROC曲線分析的過程中，計算各個指標取不同的臨界點時診斷的靈敏度和特異度，計算約登指數(Youden index)最大時的臨界點作為最佳參考值。各指標取最佳參考值時的靈敏度和特異度見表6。

表6 各中精液指標的最佳參考值

7.用綜合指標預測男性不育

利用新建立的精液綜合指標對2009年收集的100例男性不育和30例已育志愿者進行模擬診斷，根據前面得到的最佳參考值及世界衛生組織推薦的參考值預測不育，并與實際結果相比較，計算其靈敏度和特異度。在使用世界衛生組織推薦的單個指標參考值時，特異度較高但靈敏度普遍偏低。而采用SQ+ROS綜合指標時，靈敏度和特異度均較高，見表7。

表7 精液各指標預測男性不育的靈敏度和特異度

討 論

光鏡下的人工精液檢查曾經是大部分實驗室的常用的診斷方法。隨著技術的進步，計算機輔助精子質量分析(computer-aided sperm analysis，CASA)系統逐漸在男科實驗室普及，CASA使得檢測結果更加靈敏、迅速、客觀、準確〔11〕。而CASA的結果報告中有多個指標，包括精子數量和動力學參數等。然而，僅僅使用這些常規指標尚不能很好地診斷男性不育。近年來，采用熒光染色法檢查精子質膜完整性可以更精確地評估精子的存活狀態。評價精子質量的指標很多，單獨應用不夠全面，指標多又增加了臨床醫生對病情判斷的難度。為了減少指標的數量，提高診斷效率，本研究將高度相關的指標如精子密度、活動精子率、精子動力學參數、形態學指標、膜完整性進行主成分分析，計算出精液質量得分SQ，用SQ來綜合評價精液質量。

對ROC曲線進行分析后發現，SQ的曲線下面積高于單獨應用任何一種常規精液質量指標，說明SQ能夠較好地診斷男性不育。因此，在能夠進行常規精液分析和檢測存活精子率的實驗室可以參考SQ來評估精液綜合質量。

精液ROS的水平反映了氧化應激狀態，而且ROS水平與精子DNA完整性相關，是一個評價精子功能的重要指標〔12〕。另外，ROS水平除了診斷男性不育外，在預測出生缺陷、預測輔助生殖技術成功率方面也有應用價值〔13，14〕。本研究采用基于logistic回歸的多變量線性組合構建SQ-ROS聯合預測因子來診斷男性不育，其ROC曲線下面積大于單獨應用SQ或ROS，具有較高的靈敏度和特異度。盡管上述指標ROC曲線下面積都不及半透明帶結合試驗((hemizona assay，HZA)〔15〕，但該試驗操作復雜，實驗材料來源有限，在臨床上不可能批量檢測。而SQ和ROS都是目前在國內適宜推廣的檢測指標。

本研究通過主成分分析，建立了精液綜合質量得分SQ，作為一般男科實驗室診斷男性不育的參考;通過多變量線性組合，構建SQ-ROS聯合預測因子，適合在有條件檢測精液ROS水平的男科實驗室應用，并可用于輔助生殖技術中對精液質量的評估。綜合指標和最佳參考值建立后，對現有的臨床資料進行了模擬預測診斷，其靈敏度和特異度都較高，可進一步推廣。

1．Jequier AM．Semen analysis:a new manual and its application to the understanding of semen and its pathology．Asian J Androl，2010，12(1):11-13．

2．武俊青，楊秋英，陶建國，等．中國年輕男性精液質量主成分分析．中國衛生統計，2003，20(04):25-28．

3．Lamb DJ．Semen analysis in 21st century medicine:the need for sperm function testing．Asian J Androl，2010，12(1):64-70．

4．Ozaki T，Takahashi K，Kanasaki H，et al．Evaluation of acrosome reaction and viability of human sperm with two fluorescent dyes．Arch Gynecol Obstet，2002，266(2):114-117．

5．Agarwal A，Sharma RK，Nallella KP，et al．Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility．Fertil Steril，2006，86(4):878-885．

6．趙洪鑫，袁瑤，華敏敏，等．用Transgreen/PI熒光復染法檢測精子的存活率．中國男科學雜志，2008，22(04):1-4．

7．趙洪鑫，史庭燕，時偉麗，等．應用化學發光法檢測男性不育人群精液活性氧水平．中國男科學雜志，2009，23(04):14-17．

8．世界衛生組織．人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊．第4版．人民衛生出版社，2001:3-28．

9．Pepe MS，Cai T，Longton G．Combining predictors for classification using the area under the receiver operating characteristic curve．Biometrics，2006，62(1):221-229．

10．Pepe MS，Thompson ML．Combining diagnostic test results to increase accuracy．Biostatistics，2000，1(2):123-140．

11．Krause W，Viethen G．Quality assessment of computer-assisted semen analysis(CASA)in the andrology laboratory．Andrologia，1999，31(3):125-129．

12．Agarwal A，Makker K，Sharma R．Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility:an update．Am J Reprod Immunol，2008，59(1):2-11．

13．Aitken RJ，Sawyer D．The human spermatozoon--not waving but drowning．Adv Exp Med Biol，2003，518:85-98．

14．Cocuzza M，Sikka SC，Athayde KS，et al．Clinical relevance of oxidative stress and sperm chromatin damage in male infertility:an evidence based analysis．Int Braz J Urol，2007，33(5):603-621．

15．Coddington CC，Oehninger SC，Olive DL，et al．Hemizona index(HZI)demonstrates excellent predictability when evaluating sperm fertilizing capacity in in vitro fertilization patients．J Androl，1994，15(3):250-254．