混合物料發酵產物小分子肽的測定

朱長波 王勁松 陳清蟬

(1.武漢爍森生物科技有限公司，湖北荊門 448121；2.荊楚理工學院，湖北荊門 448000)

我國每年產生數億噸的各類糟粕，一方面沒能很好的利用造成巨大浪費，另一方面又從國外進口大量大豆。我們將啤酒糟、白酒糟、味精糟、糖糟等農副產品及工業廢料作為主要原料，以其他農副產品為輔助原料，加上我們的核心菌種，采用現代生物工程技術和酶工程技術，結合微生態理論，通過多菌種混合固體發酵和添加外源復合酶相結合的先進工藝，生產植物源性酶菌功能營養小肽——肽素35。

過去我們只能用單一的凝膠電泳的檢測方法,只能單一的判斷小分子肽分子量的范圍,不能準確的判斷各個分子量段的含量,從而不能準確的判斷我們的發酵產品和別人的產品的差異。為了建立一種科學、可靠和穩定的檢測方法,我們花了10年時間，通過大量的方法實驗證明,Shodex尺寸排阻色譜法是一套比較科學的檢測方法,該方法對確定小分子肽含量的測定準確、可靠。

1 待檢測原料肽素35的原料組成及比例（見表1）

表1 肽素35的組成(%)

2 小分子肽的分離提取

2.1 蛋白質提取

肽素35樣品粉碎，過0．25 mm的篩網，取100 g溶解在水中，定容到1 000 ml，在50℃的振蕩水浴鍋中振蕩提取15 h，得固液混合物。

2.2 蛋白質溶液除雜

提取結束的固液混合物先用紗布粗過濾一次，然后用濾紙細過濾一次，離心（轉速4 000 r/min，20 min）再次除去部分固型雜質。取出上清液體放入冰箱待鹽析。

2.3 鹽析

取800 ml樣品蛋白質溶液，稱取440 g硫酸銨，逐漸加入到蛋白質溶液中，邊加邊攪拌。待硫酸銨完全溶解后，放入冰箱中，放置時間15 h。

2.4 離心分離蛋白質

將鹽析完成后的蛋白質溶液加入到離心管，將離心機轉速調節到6 000 r/min，離心時間20 min。將分離出來的蛋白質用10 ml的水完全溶解，到入10 ml的試劑管中貯存。

2.5 透析

將分離出來的10 ml蛋白質溶液加入到透析袋中（膜孔徑2 nm，截留小分子肽），透析時間1 h，充分將蛋白質中的硫酸銨分離出來，避免該試劑帶來的試劑誤差，透析后得小分肽——肽素35水提物。

3 小分子肽的測定

3.1 檢測設備

LC98II-RI凝膠色譜儀、日本Shodex RI-201H示差折光檢測器。

3.2 儀器參數

色譜柱：shodes凝膠柱(Column number E008027)；流動相：H2O；流速：1.0 ml/min；標準品：普魯蘭 P-82（內裝6瓶不同分子量標準品）；樣品：肽素水提物；進樣量：10 μl；實測壓力：2.4 MPa；檢測器：Shodex RI-201h。

3.3 實驗內容

3.3.1 標準曲線制作

取各種我們已知分子量的標準品，分別配成0.5%濃度的溶液，用0.45 μm針式濾器過濾。具體標準品濃度見表2。

表2 標準品分子量

取以上標準品，按順序將以上標準品進樣10 μl，得到以下標準曲線。縱坐標是電壓值，橫坐標是各種樣品的響應時間，各點代表相應標準品峰的響應時間。具體見圖1。

3.3.2 肽素35水提物圖譜

取肽素35水提物,用同樣的實驗條件進樣10 μl,得到測試譜圖（見圖2）。

圖2 肽素35水提物凝膠色譜儀圖譜

3.3.3 標準品和肽素35水提物的圖譜對比

通過電腦系統將標準曲線圖跟肽素35水提物進樣曲線合在一起得到合并圖形（見圖3）。

從圖3我們可以找到標準品響應的點，從而找到肽素35水提物的分子量，以及對應的蜂面積所代表含量，故通過面歸一法得到肽素35水提物的分子量分布及含量（見表3）。

由表3我們可以看出10 kD以下分量小分子肽所占比例為70.46%。

4 結論

經過我們分離的菌種發酵后的肽素35，經過水提取，鹽析分離，透析除鹽后，過硅膠層析分離柱后得出一系列峰，通過面積歸一法計算出肽素35分子量范圍在5～100 kD之間，分子量10 kD以下的占水溶性小分子肽含量的70%以上。該檢測方法是可靠的也是可行的。

圖3 標準品和肽素35合并圖

表3 肽素35水提物的分子量分布