4種芽孢桿菌來源木聚糖酶基因在大腸桿菌中的表達及酶活分析

焦志華徐娥陸平李衛芬

（1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州310058；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025)

木聚糖酶在飼料、造紙、食品、能源工業和環境科學上都有著十分廣闊的用途,在飼料中添加木聚糖酶可以降解植物細胞壁,有利于動物的消化和吸收,提高飼料的利用率；木聚糖酶還可以降解可溶性多糖,降低其黏稠性，減少畜禽的腸道疾病,提高畜禽的成活率,同時還能減少環境污染。郝瑞英等[1]研究表明，斷奶仔豬低磷飼糧中添加木聚糖酶能增加鈣、磷的利用率,促進骨骼生長。俞沛初等[2]研究表明,添加木聚糖酶可顯著提高仔豬對能量、粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維等的表觀消化率,同時結果還表明,添加外源酶可使仔豬腸道某些內源性消化酶的分泌量增加。徐駿等[3]研究表明,添加0.05%木聚糖酶能提高試驗組仔雞增重,降低料重比。

木聚糖酶廣泛存在于動物、植物和微生物中,不同來源的木聚糖酶在結構和性質上有很大的差別。微生物是木聚糖酶的重要來源,它產生的木聚糖酶具有活力高、成本低、來源穩定、提取方便等明顯優點,但是天然菌株產生木聚糖酶的量較低,限制了其在工業上的應用。當前研究的熱點是通過基因工程將木聚糖酶基因進行外源表達,以提高木聚糖酶的產量,解決其在應用中的瓶頸問題。目前已有很多微生物的木聚糖酶基因被克隆測序并進行了異源表達[4-5],其中細菌木聚糖酶主要來自于芽孢桿菌屬,如環狀芽孢桿菌(B.cirxulans WL-12)[6]、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[7]、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermopHilus T-6)[8]等,但是由于表達系統的差異,無法進行表達量和木聚糖酶性質的綜合比較。因此,有必要對不同來源的芽孢桿菌木聚糖酶基因在同一表達系統中表達,然后對各表達產物的酶活、最適反應溫度及耐熱性進行分析比較,以期尋找能在大腸桿菌中穩定表達，并能產生高活性、耐高溫的木聚糖酶的基因,為工業上大量生產木聚糖酶提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體與主要試劑

浸麻芽孢桿菌（B.macerans）B3株、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)B6株、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)B10株和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)B12株、克隆宿主菌E.coli TOP10和表達宿主菌E.coli BL21(DE3)均由作者所在實驗室保存；表達載體pET-30a(+)購自Invitrogen公司；pUCm-T vector購自Promega公司；木聚糖購自Sigma公司；X-Gal、IPTG、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶和各種限制性內切酶購自TaKaRa公司(大連)；DNA Marker購自MBI公司(Maryland)；質粒提取試劑盒、PCR清洗試劑盒、割膠回收試劑盒購自上海生物工程公司。

1.2 木聚糖酶基因的PCR擴增

參照GenBank上B.subtilis和B.cirsulans木聚糖酶基因的序列，用軟件Primer5.0設計了一對引物，序列為：

上游引物(5PX)：5'-AGGGGATCCATGTTTAAGTT TAAAAAGAAT-3'；

下游引物(3PX)：5'-GATCTCGAGTTACCACACTGTTACGTTA-3'，分別加入BamHⅠ和XhoⅠ，由上海生物工程公司合成。

分別以B.macerans B3株、B.licheniformis B6株、B.cereus B10株和B.subtilis B12株為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為：10×PCR緩沖液(含Mg2+)5.0 μl；dNTP(10 mM)1.0 μl；引物各1.0 μl；模板DNA 1.0 μl；Ex Taq 0.5 μl，加水至50 μl。PCR反應條件為：首先94℃預變性5 min；然后94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，反應進行30個循環；最后72℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定。

1.3 4種木聚糖酶基因的克隆及測序

分別割膠回收4個目的基因片段，并與pUCm-T vector連接,陽性克隆送往上海博亞生物公司進行測序,用DNA tool 5.0軟件進行分析,并在網上進行同源分析,通過scanprosite服務器分析酶家族。陽性克隆子命名為pUCm-T-xyl-BX,其中X區分4種木聚糖酶基因。

1.4 重組表達質粒及基因工程菌的構建

將提取的質粒pUCm-T-xyl-BX與載體pET-30a(+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，xylBX片段插入到pET-30a(+)的相應位點，分別得到重組質粒pET-30-xyl-BX。將重組質粒轉化至E.coli BL21(DE3)感受態細胞，得到相應的工程菌BL21-xyl-BX。

1.5 目的蛋白表達

挑取單菌落接種于2.0 ml含100 μg/ml卡那霉素的LB液體培養基中，37℃150 r/min振搖培養過夜，取1 ml菌液轉接于50 ml含卡那霉素的LB中，150 r/min振搖培養至OD600到0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol/l，誘導培養6 h。

1.6 目的蛋白質的SDS-PAGE鑒定

取1.0 ml菌液4℃離心菌液收集菌體,用80.0 μl磷酸鹽緩沖液懸浮，加入20.0 ml 5×SDS-PAGE上樣緩沖液裂解,沸水浴變性處理10 min,4℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液10 μl進行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.7 木聚糖酶學特性

誘導表達后，收集菌體并超聲破碎，破碎液4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液為粗酶液，用于酶活力測定和酶學特性分析。參照Miller等[9]文獻，采用DNS法測定木聚糖酶活。

在試管中加入1 000 μl濃度為0.5%的木聚糖底物，預熱5 min，然后加入粗酶液100 μl，55℃準確反應10 min，加入500 μl DNS溶液終止反應，沸水浴5 min，冷卻后于540 nm處比色，測定OD值。根據木聚糖酶活測定標準曲線計算4種木聚糖酶的酶活。

水波相送，古道相迎，粉墻靜立，青磚不語，關于這座古鎮的印象，尚等細讀拾取。春江水暖、雁字回時再重游，好好感受古鎮清晨的寂靜，午后黃昏的紛華，藍天碧水的映襯，霓虹燈影的點綴……其實已沉醉在千年古鎮的槳聲燈影里。

酶活力單位(U)定義：每秒鐘水解木聚糖底物產生1 μmol木糖的酶量為1個木聚糖酶活力單位。

木聚糖酶的最適溫度及熱穩定性的測定方法參照Luo等[10]文獻，在40～90℃范圍內，每隔10℃設定1個反應溫度，調節pH值7.0，反應10 min后，分別測定4種重組木聚糖酶在各溫度下的酶活。不同木聚糖酶分別以各自在不同溫度下的最高酶活為100%計算相對酶活，由此確定4種不同木聚糖酶的最適溫度。

酶熱穩定性測定：4種不同酶液分別在40、50、60、70、80℃處理20 min，立即冰浴，然后測定殘余酶活性，以未處理酶樣活性為100%。

2 結果

2.1 目的基因的克隆和序列分析

經過PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，4個PCR擴增產物在650 bp左右均有一條特異條帶，與預期大小一致。

測序結果表明，4個木聚糖酶基因大小均為642 bp。經BLAST相似性分析后，結果顯示，浸麻芽孢桿菌B3株的木聚糖酶基因、地衣芽孢桿菌B6株的木聚糖酶基因和蠟樣芽孢桿菌B10株的木聚糖酶基因與已登錄的枯草芽孢桿菌木聚糖酶基因（登錄號為U51675、X59058和AF490979）序列相似性都在90%以上?？莶菅挎邨U菌B12與已登錄的枯草芽孢桿菌木聚糖酶基因（登錄號為Z99114、AF02786和M36648）序列完全一樣。其中除枯草芽孢桿菌B12木聚糖酶基因外，其他3個木聚糖酶基因均首次報道。

通過網上Clustal W軟件對4種木聚糖酶基因序列進行比對，結果顯示，這4個基因序列相互間的同源性在92%～98%間，其中，浸麻芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌木聚糖酶基因的同源性最低，為92%。同樣，對4種芽孢桿菌木聚糖酶基因的推譯氨基酸序列進行比對發現，這些氨基酸序列的同源性都在95%以上，其中浸麻芽孢桿菌和枯草桿菌及蠟樣芽孢桿菌之間的同源性最低，為95%（如圖2）。

Scanprosite分析各木聚糖酶基因編碼的氨基酸序列，發現4種酶均屬于糖苷鍵水解酶11家族，都具有特征活性位點序列PLIEYYVVDSW(103～113)，蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌木聚糖酶還具有該家族的另一個特征序列MATEGYQSSGSS(197～208)。

2.2 木聚糖酶SDS-PAGE分析（見圖3）

2.3 重組木聚糖酶的性質

2.3.1 重組木聚糖酶的酶活

4種重組酶工程菌經IPTG誘導表達后在55℃條件下測得的木聚糖酶活力差異較大，其中枯草芽孢桿菌木聚糖酶活力最高，達到98.98 U/ml，其它依次為：浸麻芽孢桿菌為36.16 U/ml，蠟樣芽孢桿菌為7.22 U/ml，地衣芽孢桿菌為3.85 U/ml。

地衣芽孢桿菌和短芽孢桿菌木聚糖酶氨基酸序列同源性為100%，而短芽孢桿菌木聚糖酶的酶活力為地衣芽孢桿菌木聚糖酶的6.8倍，分析原因，兩者基因序列的同源性為98%，其中地衣芽孢桿菌木聚糖酶基因中有較多相對于表達宿主而言的稀有密碼子，如編碼木聚糖酶的第92位氨基酸殘基Gly的密碼子在地衣芽孢桿菌和短芽孢桿菌中分別為GGA和GGG，其中前者為稀有密碼子。

2.3.2 重組木聚糖酶的最適溫度和熱穩定性（見圖4～圖5）

由圖4可知，4種重組酶的最適反應溫度均在50～60℃之間，當反應溫度低于50℃時，4種酶相對酶活力均較穩定；當反應溫度高于60℃，4種酶相對酶活力均迅速下降，但枯草芽孢桿菌木聚糖酶的相對酶活力始終高于其它3種酶，在70℃時，枯草芽孢桿菌木聚糖酶相對酶活力為73.6%，而浸麻芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌木聚糖酶的相對酶活力分別為35.2%、50%和33.3%。

由圖5可知,除蠟樣芽孢桿菌木聚糖酶外,其它3種木聚糖酶的相對耐熱溫度均為50℃。蠟樣芽孢桿菌木聚糖酶經50℃處理20 min完全失活,其它3種木聚糖酶中枯草芽孢桿菌木聚糖酶殘余相對酶活力最高,為85%,浸麻芽孢桿菌木聚糖酶殘余相對酶活為65%,地衣芽孢桿菌木聚糖酶殘余相對酶活最低,為56.6%。當溫度高于60℃時,其他3種酶的相對酶活力均迅速下降,其中枯草芽孢桿菌木聚糖酶相對來說最為耐熱。

3 討論

木聚糖酶具有重要的工業應用價值，在飼料、食品、釀酒、醫學、紡織、造紙、環境和能源等領域應用廣泛。特別是在飼料工業中，木聚糖酶能有效地提高飼料利用率。自然界中分離出的能夠產木聚糖酶的微生物大多存在著復雜的酶系，使得木聚糖酶的分離純化比較困難。目前應用較多的是通過基因工程將木聚糖酶基因連接到合適的載體上并轉化到相應的宿主菌中，這樣可以簡化木聚糖酶純化過程[11]。

大腸桿菌表達系統由于具有培養條件簡單、操作工藝成熟、培養周期短、蛋白表達量大等優點[12]，仍是目前應用最普遍的一種表達系統。但是大腸桿菌表達系統所表達的外源蛋白通常以包涵體的形式存在。研究認為，包涵體形成可能是木聚糖酶自身氨基酸序列的緣故，折疊時不能迅速被大腸桿菌識別,導致翻譯后的多肽鏈聚集成包涵體[13]。目前,已有多種方法用來解決蛋白過量表達時出現的包涵體的問題,如共表達分子伴侶、降低表達溫度、分泌到胞外培養基或周質空間等[14]。有研究報道,氨基酸突變能增加重組蛋白的可溶性[15],本實驗室的后續研究會在這方面進行嘗試。

不同來源的木聚糖酶主鏈聚合度不同，支鏈殘基的種類、數量、長度以及在主鏈上的結合位點不同，所以有不同類型的木聚糖酶。從分子角度來講，這通常是由多個基因表達為幾種同工酶的形式，也可能是由單個基因通過表達后修飾產生多個不同產物所致。這些表達后修飾包括mRNA的剪切，翻譯后蛋白的糖基化、?；揎椧约皝喕木酆系?。目前，許多生產中都離不開嗜極性木聚糖酶(包括嗜熱、嗜堿和嗜酸等)，如在食品工業中，很多加工都需要熱處理，這就要求木聚糖酶在較高的溫度下仍有較高的酶活；在造紙工業中，紙漿漂白環境為堿性，木聚糖酶需要在高pH值的環境下依然能保持較高的活性[16]。為使木聚糖酶更加高效地應用于生產中，一方面可以從一些耐極性細菌中篩選木聚糖酶基因進行外源表達；另一方面可以通過基因工程手段進行修飾，使得表達后的木聚糖酶具有耐熱、耐酸堿等性質。許多真菌產酸性木聚糖酶普遍存在糖基化現象，如Talaramyces byssochiamydoides YH-50等，通常認為，糖基化與酶抵御極端環境、維持其穩定性有關[17]。另外，可以通過在蛋白質的N末端附近一個殘基的置換和嵌合改變，引入二硫橋，使木聚糖酶的穩定性得到很大的提高，同時使在堿性條件下作用的pH值范圍也得到了擴展[17]。

4 結論

本研究對4種不同木聚糖酶基因在同一宿主菌中進行外源表達，并測定比較了表達產物的酶活、最適反應溫度及耐熱性等。試驗結果顯示，枯草芽孢桿菌木聚糖酶在大腸桿菌中表達后的酶活、最適溫度、耐熱性相對較好。后續試驗可以通過上述其他手段提高木聚糖酶的表達量、酶活及耐極性等。

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