黃金牡丹合劑對內(nèi)毒素血癥小鼠細胞因子的影響

聞 鳳，徐興然，曾忠良，羅音久，趙愛珍，陳 超，林春蓉，張亞娟，趙 原（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）

內(nèi)毒素（LPS）血癥是指革蘭陰性菌侵入血液，并在其中大量繁殖、裂解后釋放出大量LPS的病理過程，通常由感染、燒傷、燙傷等因素引發(fā)[1]，可表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）、感染性休克、缺血-再灌注損傷、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）、多器官功能不全綜合征（MODS）、多器官功能衰竭綜合征（MOFS）等[2]，死亡率極高，目前尚無特效治療措施。黃金牡丹合劑（HJM）是西南大學(xué)藥學(xué)院的科研處方，主藥為黃芩、金銀花、牡丹皮經(jīng)提取其有效部位制成的中藥合劑，其中含有黃芩苷、綠原酸、丹皮酚等有效成分，具有清熱解毒、抗炎、抗血栓和免疫調(diào)節(jié)作用。筆者通過ip自制大腸桿菌LPS復(fù)制小鼠LPS血癥病理模型，用HJM干預(yù)，初步探討該方對LPS血癥小鼠的保護作用及其機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ELX800型酶標儀（德國Invitek公司）；JY92-Ⅱ型超聲細胞粉碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試藥

HJM（西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥教研室自制，批號：20100801，規(guī)格：1 g·mL－1）；地塞米松磷酸鈉注射液（DEXA，西南藥業(yè)股份有限公司，批號：110317，規(guī)格：1 mL∶5 mg）；白細胞介素（IL）-4、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、ELISA試劑盒（美國RD公司）；水為無菌水。

1.3 動物和菌種

SPF級健康昆明種小鼠204只，體重（20±2）g，♀♂兼半；普通級新西蘭兔2只，♂，體重（2.0±0.2）kg，均由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供（生產(chǎn)許可證SCXK（渝）2007-0003）。

O型大腸桿菌，由西南大學(xué)生物制藥教研室提供。

2 方法

2.1 LPS的制備

取50 μL O型大腸桿菌（豬源致病性大腸桿菌菌株）加入到10 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、120r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h，加入到含有50 mL兔全血的5000 mL新配制LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)18 h，10000 r·min－1離心5 min收菌，生理鹽水洗滌，加入適量生理鹽水懸浮稀釋，反復(fù)凍5次，超聲細胞粉碎儀破壁，121℃高壓滅菌20 min，分裝備用，規(guī)格：5.02×1011cfu·mL－1。

2.2 小鼠72h死亡率測定

實驗分為6組，即空白（等容無菌水6只）、模型對照（等容無菌水，16只）、DEXA（0.80 mL·kg－1，9只）和HJM高、中、低劑量（1.00、0.50、0.25mL·kg－1各16只）組。ip 2倍半數(shù)致死量（10 mL·kg－1）LPS復(fù)制LPS血癥模型。復(fù)制模型0.5 h后各組ig相應(yīng)藥物，每天2次，連續(xù)3 d。觀察臨床癥候，統(tǒng)計72 h死亡率，并剖檢死亡小鼠觀察病理變化。

2.3 細胞因子含量測定

實驗分為4組，即空白（等容無菌水，5只）、模型對照（等容無菌水，40只）、DEXA（0.8 mL·kg－1，40只）、HJM（0.5 mL·kg－1，40只）組。按“2.1”項下方法復(fù)制模型。復(fù)制模型0.5 h后各組ig相應(yīng)藥物，每天2次，連續(xù)3d。分別于復(fù)制模型后6、12、18、24、48、72 h各組隨機選取5只小鼠，摘眼球取血樣，分離血清于－70℃貯藏，備用。血清中IL-4、IL-6、TNF-α含量測定采用ELISA法。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行χ2檢驗（確切概率法），計數(shù)資料以±s 表示，多重比較用SNK法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥候、剖檢結(jié)果與小鼠72h死亡率測定

小鼠臨床癥候表現(xiàn)：與空白組比較，模型對照組呼吸頻率加快，精神不振，皮毛蓬松，眼目不睜且眼眵增加，便秘或腹瀉，寒顫發(fā)抖，喜扎堆，運動減少；與模型對照組比較，HJM高、中、低劑量組臨床癥狀顯著改善。死亡小鼠剖檢發(fā)現(xiàn)：與空白組比較，模型對照組小鼠皮下血管充血明顯，四肢不同程度皮下出血，腸道、心、肝、肺、腎臟等多器官充血或出血，特別是肺、心和肝臟出血嚴重；與模型對照組比較，HJM高、中、低劑量組主要表現(xiàn)為小鼠背部皮下充血，臟器充血、出血減輕。

致病小鼠死亡時間主要集中在16～36h。模型對照組72 h死亡率為68.75%，HJM中劑量組死亡率為37.50%，比模型對照組降低31.25%（P＜0.01）；HJM高、低劑量組死亡率分別為62.50%、50.00%；空白組全部存活。72 h內(nèi)各組小鼠死亡情況見圖1。

圖1 72h內(nèi)各組小鼠死亡情況Fig 1 Deaths of mice within 72h

3.2 細胞因子含量測定

3.2.1 TNF-α含量測定 與空白組比較，模型對照組TNF-α含量顯著升高（P＜0.01），在12 h達到峰值；與模型對照組比較，從18h HJM組TNF-α含量開始顯著下降（P＜0.05）。血清中TNF-α含量測定結(jié)果見表1。

表1 血清中TNF-α含量測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Effects of levels of TNF-α in serum（±s，n＝5）

表1 血清中TNF-α含量測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Effects of levels of TNF-α in serum（±s，n＝5）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型對照組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model control group：#P＜0.05

組別空白組模型對照組DEXA組HJM組TNF-α含量/ng·L－16 h 204.92±9.62298.57±23.56＊260.08±15.31281.67±22.5012 h 204.92±9.62335.24±23.12＊282.50±17.86282.86±18.5618 h 204.92±9.62311.19±14.57＊270.95±17.22246.19±23.6#24 h 204.92±9.62308.69±17.64＊252.62±17.10280.71±20.7648 h 204.92±9.62292.62±17.60＊280.71±38.31267.92±24.4272 h 204.92±9.62291.24±25.25＊230.71±8.42#242.62±5.05

3.2.2 IL-4含量測定 與空白組比較，模型對照組IL-4含量隨時間延長逐漸升高，在24h達到峰值，有顯著性差異（P＜0.01）；與模型對照組比較，在48 h HJM組IL-4含量顯著升高（P＜0.05）。血清中IL-4含量測定結(jié)果見表2。

表2 血清中IL-4含量測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 2 Effects of levels of IL-4in serum（±s，n＝5）

表2 血清中IL-4含量測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 2 Effects of levels of IL-4in serum（±s，n＝5）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型對照組比較：#P＜0.05vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model control group：#P＜0.05

組別空白組模型對照組DEXA組HJM組IL-4含量/ng·L－16 h 50.68±2.5555.94±4.69＊61.30±2.2359.71±3.7112 h 50.68±2.5558.41±5.1260.94±6.8462.61±8.2518 h 50.68±2.5559.13±5.1267.25±9.8066.96±5.7424 h 50.68±2.5567.83±14.35＊71.21±4.8371.44±5.4748 h 50.68±2.5562.39±2.7463.12±7.9672.42±3.99#72 h 50.68±2.5558.99±4.3361.67±4.6068.55±2.05

3.2.3 IL-6含量測定 與空白組比較，模型對照組IL-6含量隨時間延長顯著升高（P＜0.01），在12 h達到峰值；與模型對照組比較，在12、18 h HJM組IL-6含量顯著降低（P＜0.01）。血清中IL-6含量測定結(jié)果見表3。

表3 血清中IL-6含量測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 3 Effects of levels of IL-6in serum（±s，n＝5）

表3 血清中IL-6含量測定結(jié)果（±s，n＝5）Tab 3 Effects of levels of IL-6in serum（±s，n＝5）

與空白組比較：＊P＜0.01；與模型對照組比較：#P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.01；vs.model control group：#P＜0.01

組別空白組模型對照組DEXA組HJM組IL-6含量/ng·L－16 h 41.53±1.7261.85±1.94＊53.63±2.0655.82±2.2912 h 41.53±1.7278.70±6.23＊68.29±4.91#65.79±2.26#18 h 41.53±1.7272.94±7.17＊60.31±2.76#61.30±2.44#24 h 41.53±1.7266.13±6.46＊60.62±3.6061.85±2.7848 h 41.53±1.7261.62±1.98＊55.14±2.0255.51±3.4272 h 41.53±1.7255.00±4.28＊50.20±0.9751.80±3.16

4 討論

近來研究發(fā)現(xiàn)，敗血癥、內(nèi)毒素血癥、膿毒癥、MODS等致死的主要原因不是細菌，而是LPS[3]。使用大腸桿菌LPS復(fù)制模型時，控制染毒劑量是關(guān)鍵，劑量過大，病理損害過強，藥物治療作用易被病理損害掩蓋，易致假陰性結(jié)果，反之，易致假陽性結(jié)果。本次研究以小鼠死亡率控制在40%～70%的范圍內(nèi)確定LPS給予劑量。小鼠ip LPS后呈現(xiàn)明顯的LPS血癥病理過程，72 h模型對照組死亡率為68.75%，小鼠剖檢可見多臟器損傷和炎癥病理過程，血清中TNF-α、IL-4和IL-6含量持續(xù)升高，表明動物病理模型復(fù)制成功。

LPS進入機體后，激活白細胞產(chǎn)生TNF-α，它是炎癥發(fā)生的重要起始因子，具有增強白細胞的趨化作用和吞噬作用[4]，增加血管壁通透性，釋放溶酶體酶和氧自由基，促進IL-1、IL-6、IL-8等的釋放，TNF-α濃度的高低與LPS血癥病情一致[5]，本研究結(jié)果與萬幸等[6]報道一致。有研究表明，IL-6能夠促進激活的巨噬細胞分化和浸潤，并上調(diào)某些細胞因子的表達，加劇炎性程度，并可介導(dǎo)肺損傷的急性期炎癥反應(yīng)[7]。本研究結(jié)果表明，IL-6含量在復(fù)制模型后6～12 h達到峰值，HJM組和DEX組IL-6含量在12h與模型對照組比較，顯著下降。抗炎介質(zhì)與促炎介質(zhì)水平失衡是炎癥發(fā)生并加重的重要因素[8]。IL-4為淋巴細胞（Th）2因子，具有抑制Th1的作用，是重要的抗炎介質(zhì)。有研究表明，IL-4可顯著抑制LPS介導(dǎo)單核細胞合成、釋放促炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1和IL-6，且呈明顯的量效關(guān)系，但IL-4產(chǎn)生比促炎介質(zhì)釋放晚，因而不能及時抑制炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)放大。本研究結(jié)果表明，復(fù)制模型后HJM組IL-4含量升高，出現(xiàn)峰值時間比促炎因子TNF-α、IL-6要晚。

HJM方中以黃芩為君，清熱燥濕、解毒，以治肺衛(wèi)之熱；銀花為質(zhì)輕氣清鮮透之品，寓有“透熱轉(zhuǎn)氣”之意，以助黃芩清解氣分實熱；丹皮清熱涼血、活血散瘀化斑；水牛角清熱涼血、清心除煩，諸藥共用以求清熱解毒、涼血散瘀之功。有研究表明，黃芩可作用于發(fā)熱的多個病理環(huán)節(jié)，其解熱效應(yīng)與直接減少IL-1 β、TNF-α和IL-6含量有關(guān)[9]，也與調(diào)節(jié)細菌致病因子的表達和致病毒力有關(guān)，具有明顯的抗炎、抗菌等作用；金銀花是常治各種感染和炎癥的中藥之一，也具有解熱、抗炎的功效[10]，對蛋清引起的局部急性炎癥有明顯的抑制作用[11]；牡丹皮具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗炎、活血化瘀等作用[12]。基于此，該組方具有清熱、解毒、抗炎、涼血、止血的功效是有實驗基礎(chǔ)的。

本研究證實，HJM通過降低TNF-α、IL-6含量，促進IL-4釋放，減輕了小鼠LPS血癥癥狀并降低死亡率。有關(guān)制劑的作用及其作用機制還有待進一步研究。

[1]張 莉，高志軍，趙 靜.美寶濕潤燒傷膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的保護作用研究[J].中國藥房，2011，22（35）：3283.

[2]Karima R.The molecular pathogenesis of endotoxic shock and organ failure[J].Mol Med Today，1999，5（7）：123.

[3]吳和平.病理生理學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2006：183.

[4]鄭世民，范春玲.動物病理生理學(xué)[M].哈爾濱：黑龍江教育出版社，2007：104.

[5]羅艷梁，華 平，朱佩芳，等.膿毒癥中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的研究[J].國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，1998，19（3）：133.

[6]萬 幸，劉倩嫻，王培訓(xùn).大承氣湯對全身性炎癥反應(yīng)干預(yù)作用的試驗研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20（2）：153.

[7]苗 健，陳曉燕，李 宏，等.復(fù)方清下湯對膿毒癥大鼠細胞因子白介素-1、白介素-6調(diào)控及肺損傷的作用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（1）：32.

[8]謝國旗，蔣建新，陳永華，等.內(nèi)毒素血癥時肝組織內(nèi)促炎因子抗炎因子的變化及其與肝損傷的關(guān)系[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2001，13（11）：668.

[9]李倩楠，葛曉群.黃芩苷的解熱作用及對細胞因子的影響[J].中國中藥雜志，2010，35（8）：1068.

[10]何 晶.金銀花的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].天津藥學(xué)，2008，5（20）：74.

[11]王林青，崔保安，張紅英，等.中藥金銀花提取物抗炎作用研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（8）：82.

[12]龍世林，陳 雅.牡丹皮藥理作用及臨床研究進展[J].中國藥業(yè)，2007，16（3）：63.