HPLC法測定蒙藥藍盆花中木犀草素和芹菜素的含量

王國英，薛培鳳，布仁，高建萍（.內蒙古醫學院藥學院，呼和浩特00059；2.內蒙古自治區食品藥品檢驗所，呼和浩特 000）

蒙藥藍盆花又稱蒙古山蘿卜花，來源于川續斷科植物窄葉藍盆花Scabiosa comosa Fisch.Ex Roem.et Schult和華北藍盆花Scabiosa tschilliensis Grunning的干燥花序，蒙藥名為陶森-陶日莫，主產于內蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北等省區[1～3]。蒙醫在臨床上用其清熱、清“協日”，主要用于治療肺熱、肝熱、咽喉熱[4]、肝火頭痛、發燒、肺熱咳嗽、黃疸等病[5]。

藍盆花中含有黃酮類化合物，現代藥理研究證明其總黃酮具有抗炎、解熱、抗氧化、對腎缺血再灌注損傷的保護作用、鎮靜、舒張外周血管、降低血壓、免疫、胰脂肪酶抑制作用等功能[6，7]。木犀草素具有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用[8]；芹菜素具有抗腫瘤、抗炎、降血壓、舒張血管、抗動脈硬化、抗焦慮、抗菌、抗病毒等作用[9]。兩者藥理作用與藍盆花的藥理作用相近。因此，建立同時測定藍盆花中木犀草素與芹菜素的含量測定方法，對蒙藥藍盆花的質量標準研究具有重要意義。

1 儀器與試藥

HITACHI L-2000高效液相色譜（HPLC）儀，含二元泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱（日本日立公司）；DZKW-D-2電熱恒溫不銹鋼水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）；AL-204電子天平（上海微川精密儀器有限公司）；AS3120超聲清洗機（昆山禾創超聲儀器有限公司）；RE-52 c旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

木犀草素、芹菜素標準品（北京偉業科創科技有限公司，純度均＞98%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。7批（批號：20080709、20090321、20090815、20090720、20090918、20090729、20090701）不同產地和商品藍盆花樣品，經內蒙古醫學院藥學院龐秀生教授鑒定均為川續斷科植物華北藍盆花S.tschilliensis Grunning的干燥花序。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（59∶41）[10]；流速：1mL·min－1；柱溫：30℃；檢測波長：345 nm；進樣量：20 μL。色譜見圖1。

2.2 混合標準品溶液的制備

分別取經40℃減壓干燥至恒重的木犀草素和芹菜素標準品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含木犀草素0.476 mg、芹菜素0.475 mg的混合標準品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 供試品溶液的制備

取本品粗粉（粉碎，過40目篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加85%甲醇60 mL，85℃回流提取2次，每次2 h，濾過，洗凈藥渣，減壓回收溶劑至干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，經0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2”項下混合標準品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密吸取3、6、9、12、15、18 μL，按上述色譜條件進樣測定。以對照品進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得木犀草素和芹菜素的回歸方程分別為Y＝2×107X+28601（r＝0.9995，n＝6）、Y＝2×107X－5798.1（r＝0.9996，n＝6）。結果表明，二者進樣量分別在0.143～0.857、0.143～0.855 μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下混合標準品溶液20 μL，按上述色譜條件重復進樣5次，計算峰面積。結果，木犀草素的RSD＝1.03%（n＝5），芹菜素的RSD＝0.95%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品適量，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，照上述色譜條件測定。結果，木犀草素含量的RSD＝1.28%（n＝6），芹菜素含量的RSD＝0.97%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液適量，分別于制備后0、1、2、3、4、6、8 h進樣測定。結果，木犀草素的RSD＝1.52%（n＝7），芹菜素的RSD＝1.27%（n＝7），表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已知含量的同一批樣品（批號：20080709）適量，共6份，精密稱定，分別按相當于藥材含量50%的量加入混合標準品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取不同批次的樣品，分別按“2.3”項下方法制備3份供試品溶液，照上述色譜條件進樣測定，計算樣品中木犀草素和芹菜素的含量，結果見表2。

由表2可見，批號為20090701的樣品中木犀草素和芹菜素的含量較低，可能是由于采集時間為7月初，正值花蕾初期（藍盆花的花期在7～9月），所以含量較低。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

木犀草素和芹菜素在340、350 nm波長處均有較大吸收，但由于木犀草素在350nm波長處的吸收峰最大，芹菜素在340 nm波長處的吸收峰最大，綜合考慮，選擇345 nm作為檢測波長。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery of test（n＝6）

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3.2 提取方法考察

本試驗首先對超聲提取方法和回流提取方法進行了比較，結果表明回流提取效果要比超聲提取效果好。隨后又通過四因素三水平正交試驗對回流提取方法進行了優化，因素水平分別為甲醇濃度（100%、85%、70%）、物料比（20、40、60）、提取時間（1、1.5、2 h）、提取次數（1、2、3次），得出最優試驗條件：濃度為85%的甲醇作為提取溶劑，物料比為60，提取時間為2 h，提取次數為2次。

3.3 柱溫的選擇

在其他條件固定的情況下，設定不同的柱溫進行考察。結果，當柱溫為30℃時，色譜峰基線穩定、保留時間適中、分離度好，因此確定合適的柱溫為30℃。

綜上，本方法準確、簡便、靈敏度高、重復性好、易于普及，可以用于蒙藥藍盆花中木犀草素和芹菜素的含量測定。

[1]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草（蒙藥卷）[M].上海：上海科學技術出版社，2004：385.

[2]中國藥品生物制品檢定所，云南省藥品檢驗所.中國民族藥志（第3卷）[M].成都：四川民族出版社，2000：523-528.

[3]羅布桑.蒙藥學[M].北京：民族出版社，1991：375-376.

[4]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準蒙藥分冊[S].1998：52.

[5]內蒙古自治區衛生廳.內蒙古藥材標準[M].赤峰：內蒙古科學技術出版社，1987：502.

[6]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草（第7卷）[M].上海：上海科學技術出版社，1999：587-588.

[7]Zheng Q，Koike K，Han LK，et al.New biologically active triterpenoid saponins from Scabiosa tschiliensis[J].J Nat Prod，2004，67（4）：604.

[8]李星霞，郭 澄.木犀草素的藥理活性研究[J].中國藥房，2007，18（18）：1421.

[9]孫 斌，瞿偉菁，張曉玲.芹菜素的藥理作用研究進展[J].中藥材，2004，27（7）：531.

[10]王錦軍，孔亞梅，劉 娥，等.RP-HPLC法同時測定香薷中游離黃酮化合物的含量[J].中國藥房，2010，21（15）：1413.