甘草次酸長循環固體脂質納米粒的制備與體外性能研究

王 炯，周小菊，胡先明（.武漢大學藥學院，武漢 43007；2.武漢遠大弘元股份有限公司，武漢430070）

甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）系甘草的主要成分甘草酸加水分解而來，也是甘草酸體內的活性代謝產物[1]，是一種五環三萜類化合物。GA又稱甘草亭酸，分子式為C30H46O4，白色針狀晶體，熔點289～291℃。現代研究表明，GA除具有抗炎、抗潰瘍、抗過敏、抗病毒、降血脂、止咳、平喘、止痛等作用外，還具有抗腫瘤增生的作用[2，3]。近幾年研究發現，GA對鼠肝細胞癌、艾氏腹水癌、皮膚癌、惡性黑色素瘤、人乳腺癌細胞、人肝癌細胞、人白血病細胞、艾滋病病毒等均有顯著的抑制作用[4～7]。由于GA為水不溶性化合物，口服后體內吸收差，生物利用度低，且個體差異性大，故開發GA的靶向制劑用于癌癥的治療已引起了廣大醫藥工作者的廣泛關注。

固體脂質納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是20世紀90年代初發展起來的一類新型給藥系統，它是將藥物包載于類脂核中形成的粒徑在50～1000nm之間的膠體給藥系統。SLN具有穩定性好、藥物載藥量高，同時又具有脂質體的毒性低，能大規模生產等優點[8]。為了延長納米粒在體內的作用時間，通常可以對納米粒進行聚乙二醇（PEG）修飾，增加其表面親水性，形成立體位阻，使納米粒躲過單核巨噬細胞系（MPS）的識別，使其在血液循環中滯留時間延長[9]。長循環固體脂質納米粒（Long circulating solid lipid nanoparticles，LSLN）可起到緩釋、靶向、提高GA生物利用度等作用。本研究選用甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE）對SLN進行PEG修飾，制備GA的長循環固體脂質納米粒（GA-LSLN），并對其理化性質、體外釋放性能和細胞毒性進行考察。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AR2130型電子天平（沈陽杰龍儀器有限公司）；DF-101 S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；RE-52型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；AH110 D型高壓勻質機（加拿大ATS工業系統公司）；高效液相色譜（HPLC）儀（大連江申分離科學技術公司）；BI-200 SM型動態光散射粒徑分布/Zeta電位測定儀（美國Brookhaven公司）；Sunrise型酶標儀（澳大利亞Tecan公司）。

1.2 試藥

GA原料藥（上海融禾醫藥科技發展有限公司）；GA對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110723-200612）；地塞米松注射液（DEXA，上海撫生實業有限公司，批號：101109）；硬脂酸（西安悅來醫藥科技有限公司）；大豆磷脂（上海太偉藥業有限公司）；泊絡沙姆188（德國BASF公司）；mPEG-DSPE（日本油脂株式會社）；水（二次重蒸水，筆者自制）；epharose CL-4 B凝膠柱（英國GE healthcare集團）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和N，N-二甲基甲酰胺為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 細胞

肝癌SK-Hep-1細胞系和急性髓細胞白血病MV 4-11細胞系，用含10%胎牛血清RPMI 1640培養液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。

2 方法與結果

2.1 GA-LSLN的制備

稱取適量大豆磷脂、硬脂酸、mPEG-DSPE和GA，加入少量乙醇使其溶解，在攪拌狀態下將有機相注入至60℃水相中，充分攪拌30 min，置于旋轉蒸發儀中進一步揮發有機溶劑，經過高壓勻質機循環勻質3～5次后，室溫放冷，過0.45μm濾膜，即得GA-LSLN膠體溶液，該膠體溶液呈半透明狀、有藍色乳光；同時按相同方法制備空白LSLN膠體溶液。

2.2 GA-LSLN形態、粒徑、表面電位的測定

取少量GA-LSLN膠體溶液，以蒸餾水稀釋至適宜濃度，吸取2滴，用2%磷鎢酸鈉負染，以透射電鏡觀察其形態及分布；用粒度測定儀測定納米粒粒徑大小，用Zeta電位測定儀測定其Zeta電位。結果顯示，GA-LSLN粒徑大小均勻，平均粒徑為130.1 nm，Zeta電位為－36.2 mV。GA-LSLN透射電鏡見圖1；GA-LSLN粒徑分布見圖2。

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 GA含量測定方法

參考有關文獻[10]，選用HPLC法測定GA含量。色譜條件：色譜柱為ODS C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-水-冰醋酸（89∶10∶1），流速為1 mL·min－1，檢測波長為250 nm，柱溫25℃，進樣量為20μL。

2.3.2 專屬性試驗 分別取處方量配比的空白LSLN、GA-LSLN和GA對照品適量，用流動相溶解后按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。結果表明，SLN輔料對GA含量測定無干擾。色譜見圖3。

圖1 GA-LSLN透射電鏡圖Fig 1TEM of GA-LSLN

圖2 GA-LSLN粒徑分布圖Fig 2 Distribution of particle size of GA-LSLN

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.3.3 標準曲線的制備 精密稱取GA對照品適量，以1.0%NH3·H2O-甲醛（2∶8）溶液先制備成1 mg·mL－1的GA貯備液。精密吸取GA貯備液，以1.0%NH3·H2O-甲醛（2∶8）溶液制備成濃度為1、2、10、20、40、80μg·mL－1的溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定各濃度下溶液的峰面積。以GA濃度（c）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝67006c+7762.7（r＝0.9996）。結果表明，GA濃度在1～80μg·mL－1范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。檢測限（信號S和噪聲N的比值（S/N）＝3）為0.01μg·mL－1。

2.3.4 精密度試驗 精密量取GA貯備液2、40、80 μL，分別置于10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制備成2、40、80 μg·mL－1的低、中、高濃度溶液，每個濃度分別進樣5次。按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算日內精密度和日間精密度（5 d）。結果，日內RSD分別為1.07%、0.59%、0.41%（n均為5），日間RSD分別為2.51%、0.74%、0.54%（n均為5），表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 精密量取自制同一批GA-LSLN適量，共6份，分別置于100mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，按“2.3.1”項下色譜條件測定。結果，RSD為0.25%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗 精密量取自制同一批GA-LSLN適量，共3份，置100 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制備成2、40、80 μg·mL－1的低、中、高濃度溶液，于4℃貯藏。按“2.3.1”項下色譜條件分別測定1、2、4、6、10、14、22、30d后的峰面積。結果，低、中、高濃度的RSD分別為1.03%、0.78%、0.81%（n均為8），表明GA-LSLN在4℃下30 d內穩定。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密量取空白LSLN溶液1 mL，共9份，分別置于10 mL量瓶中，分別精密加入濃度為1 mg·mL－1的貯備液，加流動相稀釋至刻度。按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果，平均回收率為（99.72±0.24）%（n＝9）。

2.4 包封率、載藥量與體外釋放度的測定

2.4.1 包封率與載藥量的測定 取適量GA-LSLN膠體溶液，過sepharose CL-4 B凝膠柱，以蒸餾水為洗脫液，分離出GA-LSLN和游離GA，用試管收集不同時間段的洗脫液，每管1 mL，收集15份，洗脫液用適量的乙醇稀釋后，測定每份洗脫液中GA的峰面積積分值。以洗脫體積為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制洗脫曲線。包封率按下式計算：包封率＝AUCGA-LSLN/（AUCGA-LSLN+AUCfree-GA）×100%（式中，AUCGA-LSLN為洗脫曲線中GA-LSLN中GA曲線下面積；AUCfree-GA為洗脫曲線中游離GA的曲線下面積）。另精密量取1 mL的GA-LSLN膠體溶液，用甲醇破乳并稀釋，測定GA含量，按下式計算載藥量：載藥量＝MGA/Mlipid×100%（式中，MGA為GA-LSLN中GA的量；Mlipid為GA-LSLN中脂質的量）。結果，GA-LSLN的包封率為94.6%，載藥量為11.3%。GA-LSLN和游離GA的洗脫曲線見圖4（在第8 mL收集液中GA含量為零，即8 mL為分界點，前為GA-LSLN峰，后為游離GA峰）。

圖4 GA-LSLN和游離GA的洗脫曲線Fig 4 Separation curves of GA-LSLN and free GA

2.4.2 體外釋放度的測定 以200 mL含0.5%的十二烷基硫酸鈉和30%乙醇的pH 7.4的PBS溶液為介質[11]，精密移取2 mL GA-LSLN膠體溶液，置于透析袋中（截留分子量8000），磁力攪拌。分別于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0 h取釋放液0.5 mL，過0.45μm的微孔濾膜，進行HPLC分析，同時補充同溫度的溶出介質1 mL。測定GA濃度，按下式計算累積釋放百分率（Q）：Q（%）＝Ct/C0×100%（式中，Ct為釋放的藥物量；C0為脂質體中初始藥物量）。以時間（t）為橫坐標，Q為縱坐標，繪制體外釋藥曲線。將所得數據與一級、Higuchi、Weibull方程進行擬合。結果表明，其釋放規律更符合一級速率過程。GA-LSLN體外釋藥曲線見圖5；體外釋藥曲線回歸方程擬合見表1。

圖5 GA-LSLN體外釋藥曲線Fig 5 Drug release curves of GA-LSLN in ritro

表1 體外釋藥曲線回歸方程擬合Tab 1 Fitted regression equation of drug release curves

2.5 體外細胞毒性試驗

取對數生長的SK-Hep-1肝癌細胞，以0.5×104個/L種植于96孔板；白血病細胞MV4-11，以1×105個/L種植于96孔板，選用游離藥物DEXA為陽性對照，將DEXA、GA和GA-LSLN按1∶4的倍數稀釋成一系列濃度，加入種植了癌細胞的96孔板中，各種條件平行做5孔，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養48 h，每孔加入20μL 5 mg·mL－1的MTT溶液，繼續培養4 h，吸去培養液，每孔加入二甲基亞砜200μL，振蕩，充分溶解，置于酶標儀上570 nm波長處測定吸光度，以濃度對數值對細胞存活率作圖，計算各樣品對肝癌細胞SK-HEP-1和白血病細胞MV4-11的半數抑制濃度（IC50）。GA-LSLN、游離GA和DEXA對SK-Hep-1和MV4-11細胞的IC50值見表2。

3 討論

表2 GA-SLN、游離GA和DEXA對SK-Hep-1和MV4-11細胞的IC50值（μmol·L－1，n＝5）Tab 2 IC50of GA-SLN，free GA and DEX to SK-Hep-1 and MV 4-11（μmol·L－1，n＝5）

因文獻報道在肝實質細胞上存在GA受體，GA的趨肝性和肝靶向性引起了醫藥工作者的高度關注，人們將目光紛紛轉向于以GA修飾的脂質體和納米粒作為肝靶向載體材料的研究[12]。GA本身作為一種抗腫瘤藥物，在中藥復方制劑中一直被廣泛應用于臨床，但開發新型GA靶向制劑，在抗癌藥物制劑領域仍然具有誘人的前景。

本研究采用乳化溶劑揮發-高壓勻質法制備GA-LSLN，該工藝簡單、可行，所制得的SLN粒徑適宜且大小均勻。本處方中加入mPEG-DSPE，不僅可以增加納米粒的穩定性，而且因納米粒表面具有PEG鏈，使其更具有長循環功能。

GA為脂溶性藥物，在pH7.4的PBS中溶解度較小，因此在選擇透析介質時使用了0.5%的十二烷基硫酸鈉和30%乙醇，以保證一個處方量的GA能完全溶解，同時又不會造成GA在平衡時間內從SLN中滲漏。體外釋放曲線符合一級速率過程，說明藥物主要以被動擴散的形式從SLN中釋放到溶出介質。

細胞毒性試驗選用DEXA作為陽性對照藥物，是因為GA的化學結構與甾體激素類藥物DEXA相似，同時DEXA也被用于肝癌和急性白血病的治療[13，14]。研究表明，GA和GA-LSLN對肝癌細胞SK-Hep-1和急性髓細胞白血病MV 4-11具有較強的細胞毒性，而GA-LSLN對這2種細胞的IC50均比游離GA大，說明其細胞毒性比游離藥物小，其主要原因是因為GA從GA-LSLN中緩慢釋放，在相同時間內，GA-LSLN中與細胞接觸的游離GA濃度低。該制劑對肝癌和急性白血病的治療作用有待進一步進行體內活性研究。

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