秦皮乙素對小鼠皮下Hepa1-6肝癌移植瘤凋亡基因Bcl-2、Bax表達的影響Δ

王麗紅，偉忠民（1.遼寧醫學院，遼寧錦州121001；2.遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000）

秦皮為常用中藥，始載于《神農本草經》，列為中品，以后歷代主要本草均有記載。2010年版《中國藥典》收載了4種秦皮，視為正品，來源為木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance、白蠟樹F.chinensis Roxb.、尖葉白蠟樹F.szaboana Lingelsh.或宿柱白蠟樹F.stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮[1]。秦皮乙素（Esculetin）為秦皮的有效成分之一?，F代藥理學研究表明，秦皮有抗病原微生物、抗炎、鎮痛和抗腫瘤等作用[2]。前期體外細胞試驗證明，秦皮乙素對人肝癌細胞有殺傷作用，筆者進一步研究秦皮乙素對小鼠肝癌皮下瘤生長的抑制和對相關凋亡基因的影響，探討其抗癌的相關機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Napro-6100型CO2培養箱（美國杜邦公司）；YG-875 B型無菌超凈工作臺（上海醫療器械廠）；KA-1000 C型飛鴿離心機（上海安亭科學儀器廠）；CX21型雙目生物顯微鏡（日本Olympus公司）；WD-9413 B型凝膠成像分析儀（上海圣科儀器設備有限公司）；DYY-7 C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Life Express PCR儀（杭州四格生物有限公司）；NANO 2000型紫外分光光度計（美國Thermo公司）。

1.2 試藥

秦皮乙素（筆者自制，含量：94.47%，平均收率：96.35%）；注射用環磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：09031521，規格：0.2 g/支）；DMEM培養基（美國Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；兔抗鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Bcl-2、Bax引物由上海生工生物工程有限公司設計合成；其余試劑均為國產分析純。

1.3 動物與細胞株

C57 BL/6 J小鼠60只，6～8周齡，♂，體重20～22 g，由中國醫科大學動物實驗中心提供（動物生產許可證號：SYXK（遼）2008-0005）。Hepa1-6細胞株購于中國科學院上海分院細胞庫。

2 方法

2.1 復制模型與分組、給藥

Hepa1-6細胞、DMEM（高糖）90%、胎牛血清10%置于37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞處于對數生長期時，0.2%臺昐藍染色，活細胞密度＞95%。收集細胞于PBS中，制成單細胞混懸液，參照文獻[3]每只小鼠右腋sc 0.2 mL（約1×107個）。模型復制成功后，小鼠隨機分成5組，即模型（生理鹽水0.2 mL）、CXT（100 mg·kg－1）和秦皮乙素高、中、低劑量（700、400、200 mg·kg－1）組。復制模型3 d后ip給藥，每天1次，連續15 d。

2.2 抑瘤率的計算

于末次給藥24 h后，麻醉小鼠取出瘤組織，稱重。抑瘤率（%）＝（1－給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。

2.3 秦皮乙素對Bax mRNA、Bcl-2mRNA表達的影響

按照試劑盒說明提取總RNA，提取的RNA經紫外分光光度儀分別測量260、280 nm波長處吸光度，由260 nm波長處吸光度計算出RNA濃度。按照RT-PCR試劑盒說明進行PCR擴增。凝膠電泳觀察可見18、28S RNA帶。Bax上游引物：5′-CCAGGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游引物：5′-AGCA AAGTA-AAGAGGGCAACCAC-3′；Bcl-2上游引物：5′-CTCTGGTTGGGATTCCTACGG-3′；下游引物：5′-CGGCATGATCTTCTGTCAAGTTTA-3′；GAPDH 上游引物：5′-TGTTCCTACCC-CCAATGTGTCCGTC-3′，下游引物：5′-CTGGTCCTCAGTGTAGCC-CAAGATG-3′。反轉錄條件：95℃ 加熱5 min終止反應，置冰上進行后續實驗或冷凍貯藏。然后進行30個周期的PCR擴增反應，PCR擴增反應參數設置如下：95℃、5min預變性1個循環，每個周期為95℃變性20s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s。取PCR產物10μL與2μL的上樣緩沖液混合，用1×TAE緩沖液配制2%瓊脂糖進行水平平板電泳，電壓5 V·cm－1，電泳40 min，在紫外光燈下觀察，應用凝膠成像系統進行統計學處理。分別以Bax、Bcl-2與GAPDH比值作為其相應的表達參數，對Bax mRNA、Bcl-2 mRNA產物相對定量。

2.4 秦皮乙素對Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

將存于－80℃冰箱中的組織解凍，加入裂解液制成勻漿，高速離心后取上清液，測出蛋白含量后加入上樣緩沖液混勻，水浴加熱5 min后－20℃冰箱中保存。灌制10%SDS-PAGE分離膠與濃縮膠于電泳液中進行上樣，電泳后采用半干法將蛋白轉印于PVDF膜上，TBS沖洗，封閉液封閉0.5h加入一抗，4℃過夜，洗膜。加入二抗，室溫下在搖床上雜交1 h，洗膜3次。NBT/BCIP顯色，應用凝膠成像分析系統進行掃描照相。以四星圖像處理系統測定各組蛋白表達量與內參GAPDH表達量的比值作為各自表達水平的參數。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 秦皮乙素對小鼠皮下肝癌瘤的抑制作用

秦皮乙素高、中、低劑量組抑瘤率分別為55.42%、40.37%、20.33%，各組瘤重指數（瘤重指數＝各組瘤重/小鼠體重）均顯著低于模型組（P＜0.01）。秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用見表1。

表1 秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用（±s，n＝8）Tab 1 Inhibition effects of aesculetin on tumor growth of model mice（±s，n＝8）

表1 秦皮乙素對模型小鼠腫瘤生長的抑制作用（±s，n＝8）Tab 1 Inhibition effects of aesculetin on tumor growth of model mice（±s，n＝8）

與模型組比較：＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.01

組別模型組秦皮乙素低劑量組秦皮乙素中劑量組秦皮乙素高劑量組CTX組n 88888劑量/mg·kg－1-200400700100瘤重指數1.358±0.13021.039±0.0029＊0.772±0.0065＊0.589±0.0013＊0.487±0.0047＊抑瘤率/%-20.33＊40.37＊55.42＊65.03＊

3.2 秦皮乙素對Bax mRNA、Bcl-2mRNA表達的影響

按照實驗方法中的步驟進行提取的RNA經紫外分光光度計測量260和280 nm吸光度的比值均為1.8～2.0。與模型組比較，Bax mRNA表達隨著秦皮乙素劑量的增高熒光強度逐漸增強，顯著高于模型組（P＜0.01），Bcl-2 mRNA的表達隨著秦皮乙素劑量的增高熒光強度逐漸減弱，顯著低于模型組（P＜0.01）。結果表明，秦皮乙素對小鼠皮下肝癌瘤組織Bax基因表達起到促進作用，對Bcl-2基因表達起到抑制作用。mRNA表達見圖1。

圖1 mRNA表達Fig 1 The mRNAexpression

3.3 秦皮乙素對Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

分別檢測不同組中Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達量（條帶灰度值），其與內參β-actin表達量的比值為相對表達量。與模型組比較，秦皮乙素高、中、低劑量組Bax蛋白表達受到明顯激活，而Bcl-2蛋白表達受到明顯抑制，與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。蛋白表達見圖2。

圖2 蛋白表達Fig 2 The protein expression

4 討論

近年來，從天然動、植物中尋找毒性低、療效高的抗腫瘤藥物已成為當前國內、外研究的熱點和共識[4]。目前，誘導腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤的一個重要途徑[5]。中藥的抗腫瘤機制之一就是誘導腫瘤細胞凋亡，許多中藥的有效成分或其提取物具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用[6]。Bcl-2家族是細胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白，分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白，Bax是廣泛的促凋亡蛋白。大多數惡性腫瘤細胞凋亡發生異常時，Bcl-2表達升高，Bax表達下降。過高的抑凋亡蛋白表達打破了正常細胞凋亡機制，使癌癥細胞獲得了生長的優勢，對凋亡信號表達不敏感[7]。在促凋亡因素的刺激下，抑制Bcl-2的表達，促進Bax的表達。通過上調Bax與Bcl-2比值，誘發腫瘤細胞發生凋亡。體外細胞試驗發現，秦皮乙素能抑制人肝癌細胞增殖，阻滯于S期，誘導肝癌細胞凋亡[8]。體內抑瘤實驗結果是評價抗腫瘤藥物有效性的重要指標，其中移植性動物腫瘤模型具有接種成功率高、實驗周期短、重復性好等優點[9]。所以，本研究選用近交系C57 BL/6 J小鼠sc鼠源Hepa-6細胞復制模型。結果表明，秦皮乙素對小鼠肝癌皮下瘤生長起到不同程度的抑制作用，并呈現劑量依賴性，各劑量組瘤重均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）。CTX組抑瘤率高于秦皮乙素各劑量組，但與秦皮乙素各組相比小鼠嚴重消瘦，毛色無光澤，食欲、活動力均下降，出現了化療藥物的不良反應。秦皮乙素各組小鼠狀態良好，其中高劑量組抑瘤率與CTX組相近。RT-PCR、Western blot檢測結果表明，秦皮乙素促進了Bax基因與蛋白的表達，降低了Bcl-2基因與蛋白的表達。綜上所述，秦皮乙素可促進腫瘤細胞的凋亡，其誘導小鼠肝癌瘤細胞凋亡的機制之一可能是調節凋亡基因Bax/Bcl-2的表達水平，但具體是哪一種凋亡途徑啟動Bax、Bcl-2基因的表達，還有待進一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：245.

[2]方蓮花，呂 楊，杜冠華.秦皮的藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2008，33（23）：2773.

[3]周忠信，呂明德，殷曉熠，等.C57 BL/6 j小鼠接種Hepa1-6細胞誘導皮下肝癌模型的建立[J].廣東醫學，2007，28（2）：178.

[4]劉明華，肖 順，任美萍，等.克癌新及其拆方對荷瘤小鼠腫瘤生長和細胞因子的影響[J].時珍國醫國藥，2010，21（12）：3150.

[5]吳 劍，滕國英.中藥誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展[J].國際醫藥衛生導報，2007，13（8）：114.

[6]陳香濤.中藥抗腫瘤機制研究進展[J].中國實用醫藥，2010，5（14）：238.

[7]李曉琦，原繼榮.Bcl-2/Bax在宮頸癌診斷中的研究進展[J].中國優生與遺傳雜志，2010，18（8）：468.

[8]王 晶，王洪新，李紅玉，等.秦皮乙素的制備及對人肝癌細胞SMMC-7721體外增殖的影響[J].中國現代應用藥學，2009，26（6）：439.

[9]戰曉農，余衛華，劉 戀，等.雙氫青蒿素干預結直腸癌模型動物腫瘤生長的實驗研究[J].廣東中醫藥大學學報，2009，26（5）：465.