應用高效液相色譜同時測定牛奶中三種四環素的方法研究

孫立新

（天津市乳品食品監測中心，天津 300381）

四環素類抗生素具有廣譜的抗菌作用，經常用于預防和治療奶牛的乳腺炎、子宮炎[1]。但是有研究證明，四環素類抗生素可通過奶的攝入進入人體，導致人的毒副作用及過敏反映[2]。為了保護人類健康，世界衛生組織（WHO）、美國食品藥品監督管理局（FDA）以及歐共體（EU）等都限定了奶中四環素類抗生素的殘留量，如土霉素的最大殘留量為0.1μg/mL，以切實保證人類的食品安全[3]。

20世紀90年代，四環素類藥物殘留的分析方法主要有微生物法、薄層色譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法和液譜-質譜聯機法[4-6]等，但是這些方法中，或存在檢測靈敏度低、或存在檢測方法所需儀器設備復雜昂貴等缺陷，難以滿足實際檢測工作的需要[7-9]。

本研究以當前食品檢測普遍采用的高效液相色譜儀為手段，通過建立適當的提取和純化方法、優化色譜分析方法，以實現乳中三種四環素類抗生素的同時檢測分析。

1 材料與方法

實驗材料：牛奶樣品，采自農場生鮮牛乳。

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（美國waters公司，600E型），配備996型二極管陣列檢測器（PDA），pHs－25酸度計（上海精密科學儀器公司）；紫外分光光度計（UNICAM，）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；渦旋振蕩器。

C18固相萃取柱（Warian Bond Elut，100 mg/1 mL）。

四環素（tetracycline,TC）、土霉素（oxytetracycline,OTC）、金霉素（chlortetracycline,CTC）由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈（色譜純）；水為超純水；檸檬酸、乙二氨四乙酸二鈉（Na2EDTA）、磷酸氫二鈉（分析純）。

1.2 色譜條件

色譜柱為Nova-PakC18（美國waters公司，150mm×3.9 mm×4.5μm）。

采用草酸0.01 mol/L（pH=2.0）—乙腈—甲醇三元梯度洗脫，洗脫程序為：100%草酸1 min，5 min內變為草酸∶乙腈∶甲醇＝70∶8∶22，并維持 10 min。

流動相流速為0.8 mL/min，進樣量20μL，室溫檢測，檢測波長360 nm。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

準確稱取10 mg TC、OTC、CTC標準品，分別用甲醇定容到100 mL棕色容量瓶中，作為標準貯備液。吸取一定量的標準貯備液用0.01 mol/L的草酸甲醇稀釋到適當濃度配制標準工作液。

MCI-Vaine 緩沖液[10]：準確稱取Na2HPO428.41 g，用水溶解，定容到1000 mL容量瓶中，簡稱溶液A。準確稱取檸檬酸21.00 g，用水溶解，定容到1000 mL容量瓶中，簡稱溶液B。取625 mL溶液A和1000 mL溶液B混勻，以酸度計調節pH至4.0+0.1。

MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液：準確稱取Na2EDTA 60.49g溶解于1625mL的MCI-Vaine液中，配成0.01mol/L Na2EDTA的MCI-Vaine緩沖液。

0.01 mol/L草酸溶液：準確稱取草酸1.26 g，用水溶解并定容于1000 mL容量瓶中。以酸度計調節pH=2.0。

0.01 mol/L草酸甲醇溶液：準確稱取草酸1.26 g，用甲醇溶解并定容于1000 mL容量瓶中。

1.3.2 樣品處理

準確量取2 mL巴氏消毒奶置于離心管中，加入2 mL MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液，在渦旋振蕩器上振蕩 2 min，離心（5000 r/min）10 min，小心傾出上清液。在沉淀中再加入2 mL MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液，同樣方法提取、離心。提取液合并后，用預先活化的C18固相萃取柱進行純化、富集，吸附速度控制在1mL/min，以3 mL蒸餾水淋洗后，用1 mL的0.01 mol/L草酸甲醇洗脫。洗脫液經0.45μm濾膜過濾后進行HPLC分析。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

四環素類抗生素屬于酸堿兩性物質，易與蛋白質強烈結合，提取時需要用酸性物質將蛋白脫除。由于四環素類抗生素在酸性（pH<2.0）或堿性（pH>7）的條件下中易發生降解，在弱酸性溶液中相對穩定。因此，本實驗選用了含有EDTA的弱酸性溶劑0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液（pH4.0）作為提取溶劑。

2.2 檢測波長的選擇

檢測波長的選擇見圖1。利用紫外可見分光光度計在190 nm～400 nm波長范圍內進行掃描，得到3種四環素類抗生素的吸收圖譜，發現3種抗生素有相似的吸收光譜，在268 nm和350 nm處各有一個吸收峰。分別在兩個波長下進行檢測，發現在360 nm下基質干擾最小，基線平穩，所以選擇360 nm為檢測波長。

圖1 3種四環素掃描光譜圖Fig.1 Scanning spectrum of 3 tetracyclines

2.3 流動相的選擇

2.3.1 草酸濃度及pH的選擇

綜合國內外研究進展發現，流動相中草酸的濃度和pH對于四環素的檢測和分析至關重要，因此，本實驗中針對此因素進行了比較研究。

四環素類藥物結構中活性基團較多,主要以陽離子形式存在，流動相中加入草酸可以與四環素類藥物形成離子對，從而降低了對色譜柱硅醇基的吸附，避免拖尾現象。本實驗選擇用純水和濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.05 mol/L的草酸進行了測試，發現流動相中不使用草酸時，色譜峰嚴重拖尾，加入草酸后分離度增加，峰形變尖。不同的草酸濃度對分離效果影響不大，因此，本實驗選擇草酸的濃度為0.01 mol/L。

草酸溶液的pH對組分的分離效果也有一定的影響。本實驗分別用pH為2.0、3.0和4.0的0.01 mol/L草酸溶液作為流動相進行了測定，發現三種條件下，三種四環素均能分開，但隨pH的降低，各峰間的分離度增大，峰形尖銳，對稱性好。如果pH過低（pH＜2.0），四環素會發生降解，同時也不利于色譜柱的保護。因此，本實驗選擇草酸的pH為2.0。

2.3.2 色譜條件的選擇

實驗分別采用不同的流動相組成進行了分離效果的對比。結果發現，采用甲醇-乙腈-0.01 mol/L草酸（1.5+1.5+2.0，pH=2）作為流動相進行分析時，出峰時間短，三種四環素保留時間相似，無法分離；采用乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉（pH2.5）作為流動相，四環素和土霉素無法分離；選用0.01 mol/L草酸-乙腈-甲醇進行三元梯度洗脫，三種四環素得到較好的分離，因此本實驗選擇三元梯度洗脫。下圖2為該色譜條件下，三種四環素標準色譜圖和樣品添加色譜圖。

圖2 3種四環素標準色譜圖和樣品添加色譜圖Fig.2 Standard spectrum and added sample spectrum of 3 tetracyclines

從圖2可以看到，奶樣中的三種四環素類藥物均能達到基線分離，分離效果較好。出峰順序依次為土霉素、四環素、金霉素。以x代表濃度（mg/L），y代表峰面積，測定三種四環素的標準曲線，以3倍信噪比求出檢出限。結果見表1。

表1 3種四環素標準曲線的回歸分析Table 1 Regression analysis for standard line of 3 tetracyclines

由表1可以看出三種四環素類藥物的標準曲線相關性較好，最低檢出限均能達到國標的獸藥殘留最低限量要求。

2.3.3 加標回收率測定

分別吸取5 mL空白奶樣于離心管中，各加入不同濃度的相應抗生素混樣，加標后用渦淪振蕩器振蕩5 min混合均勻，在冰箱中放置12 h后提取，使藥物均勻擴散到奶中。每個濃度重復3次。結果見表2。

上述結果顯示，應用本方法能夠有效檢測到奶制品中的土霉素、四環素和金霉素等抗生素殘留，方法的加標回收率103%～109%之間，變異系數在4.46%～8.55%之間。

表2 奶中三種四環素的加標回收率（n=3）Table 2 Recoveries of 3 tetracyclines in milk(n=3)

2.3.4 C18固相萃取柱反復使用效果的比較

取三種濃度為0.20 mg/L的四環素MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液5 mL，加入到活化后的C18固相萃取柱中，按樣品處理方法進行富集、洗脫后，進行HPLC分析。C18固相萃取柱反復使用五次，通過其回收率，確定其反復使用的可行性。結果見表3。

表3 C18固相萃取柱反復使用效果的比較Table 3 Comperison of reuse effectiveness of C18solid extraction column

結果說明，本方法中用于純化樣品的C18固相萃取柱可以多次反復使用，這樣的操作有助于降低該方法的分析成本。

同時，在檢測中發現，四環素類抗生素在pH＝4的MCI緩沖液中不穩定，在室溫下8 h大約損失3%，因此提取物在分析前應保存在4℃冰箱中以降低損失；提取物在-20℃可穩定2 d。由于四環素類對光敏感，因此在整個操作過程中盡量避免日光直射。

3 結論

采用固相萃取純化，應用梯度洗脫，建立了一種同時檢測牛奶中3種四環素類藥物殘留的HPLC方法。通過流動相構成比較、線性關系、最低檢出限以及空白樣品加標回收率比較，證明該方法簡便可行、結果可靠，可用于對牛奶中四環素類藥物殘留的檢測。

同時通過多次反復實驗，證明本方法用于純化樣品的C18固相萃取柱可以多次反復使用，這有助于降低本方法的分析成本，利于方法的推廣和應用。

[1]王蕾,徐智秀.反相高效液相色譜法快速測定7種四環素類抗生素[J].分析化學研究簡報,2003(1):52-54

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[7]呂保克.食品分析大全[M].北京:高等教育出版社,1997:882

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[9]李俊鎖,邱月明,王超.獸藥殘留分析[M].上海:上海科學技術出版社,2002:365

[10]中華人民共和國農業行業標準.中華人民共和國農業部,NY 5029-2001[S].