LC-MS/MS測定腸衣中7種大環內酯類抗生素殘留量

林維宣，陳溪，張寧，董偉峰，王秋艷，趙景紅

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001；2.大連出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001）

大環內酯類抗生素是獸醫臨床上十分重要的一類抗生素，廣泛用于畜禽細菌性和支原體感染的化學治療，同時也是重要的生長促進劑，在動物藥品和飼料添加物中占有重要位置。它包括螺旋霉素（spiramycin）、替米考星（tilmicosin）、竹桃霉素（oleandomycin）、泰樂菌素（tylosin）、紅霉素（erythromycin）、羅紅霉素（roxithromycin）、交沙霉素（josamycin）等多種獸藥[1]。

食品中大環內酯類藥物殘留可引起過敏和攜帶耐藥基因的擴散，對人們威脅很大，許多國家對大環內酯類抗生素在動物上的使用和在食品中的殘留進行了嚴格的監控。美國、歐盟、日本等國家都已規定了大環內酯類抗生素在動物源性食品中的殘留限量。

大環內酯類獸藥的檢測方法主要有：微生物法、免疫分析法（ELISA）、薄層色譜法（TLC）、氣質聯用法（GC/MS）、高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用法（LC/MS，LC-MS/MS）等。微生物效價法選擇性低，特異性不高，且僅檢測單一藥物的殘留。免疫分析法（ELISA），特別是近來發展的放射受體分析法（CharmⅡ法），涉及的樣品前處理簡單、快速，具有良好的特異性和靈敏度，但因影響因素多且難以控制，難以實現多殘留分析。薄層色譜法主要應用于原料藥和制劑中大環內酯類獸藥的分析。該方法設備簡單，檢驗成本低，操作簡便快速，但缺點是分離能力較差，檢測靈敏度較低，不適合食品中MALs殘留的微量分析。由于大環內酯類抗生素分子量比較大（一般都在500以上），且分子結構中大多帶有多個極性基團，不能直接采用氣相色譜方法檢測，必須衍生后才可以用氣質聯用法檢測。由于衍生過程繁瑣，對于動物產品樣品處理過程十分復雜，限制了該方法的應用。高效液相譜法檢測大環內酯類抗生素盡管有些文獻報導[2-4]，檢測器通常為紫外檢測器。近年來液質聯用法檢測大環內酯類抗生素的研究比較活躍,用液相色譜-串聯質譜法檢測牛奶、蜂王漿、蜂蜜、鰻魚、目魚、河水中大環內酯類抗生素的方法已有報導[5-10]。

本課題利用液相色譜-串聯質譜檢測技術，研究建立腸衣中多種大環內酯類抗生素殘留量的檢測和確證方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

液相色譜-串聯質譜儀：美國AB公司API4000，配有電噴霧離子源；固相萃取裝置：Waters公司，12孔；HB－4型旋轉蒸發器：IKA公司；LD5－2A離心機：轉速4000 r/min 以上；均質器：美國 WARING，10000 r/min；氮吹儀：美國Organomation氮吹儀N－EVAPIII型，24孔。

1.2 主要材料與試劑

10 mmol/L乙酸胺溶液（pH 4.5），0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=8.5），0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）。C18固相萃取小柱（500 mg/6 mL），Oasis（HLB）固相萃取小柱（500 mg/6 mL），MCX固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素磷酸鹽、泰樂菌素酒石酸鹽、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素標準品：純度大于等于95%。

7種大環內酯標準儲備溶液：分別稱取經折算適量標準品，分別用甲醇溶解為濃度為100μg/mL，1℃～4℃冰箱保存，臨用前根據需要用甲醇稀釋適當濃度的工作液。

1.3 提取和凈化

1.3.1 提取

稱取5 g均勻試樣（精確到0.01 g）置于50 mL具塞離心管中，加25 mL甲醇，渦旋，于4000 r/min離心3 min，將上層甲醇提取液收集于50 mL容量瓶中，再加20 mL甲醇，重復上述操作，合并甲醇提取液，加甲醇定容至50 mL。精密量取10 mL甲醇提取液于20 mL離心管中，在45℃以下水浴減壓濃縮至近干，用15 mL磷酸鹽緩沖溶液分次溶解殘渣。

1.3.2 凈化

Oasis（HLB）小柱（500 mg，6 mL，或相當者）依次用5 mL甲醇、5 mL水預洗。將提取液轉移過HLB凈化柱，棄去流出液，用 5 mL 水和 5 mL 甲醇－水（3∶7，體積比）依次洗滌離心管，洗滌液過HLB柱，棄去流出液，負壓抽干，用6 mL甲醇洗脫。收集全部洗脫液，在45℃以下水浴減壓濃縮至近干，加2 mL甲醇－水（1∶1，體積比）溶解，混勻，過0.22μm針筒濾膜，進LC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

液相色譜柱：ZORBAXEclipseC8柱，5μm，150mm×4.6 mm（i.d）；流動相：B 組分是乙腈，A 組分是 0.15%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0→3.5min，A=70%→30%；3.5→8 min，A=30%；8→10 min，A=30%→70%；10→16 min，A=70%。流速：400μL/min；進樣量：20μL。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源。掃描方式：正離子掃描。檢測方式：多反應選擇離子檢測（MRM）。分辯率：Q1和Q3均為單位分辨率。電噴霧電壓：5500V。電噴霧電壓（IS）：4800 V；霧化氣壓力（GS1）：42 Psi（即289.6×103Pa）；氣簾氣壓力（CUR）：25 Psi（即172.4×103Pa）；輔助氣流速（GS2）：45 Psi（即310.3×103Pa）；離子源溫度（TEM）：540℃；碰撞氣（CAD）：6 Psi（即41.4×103Pa）。其它參數見表1。

表1 質譜參數Table 1 MS parameters

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

分別選用 ZORBAX Eclipse XDB-C85μm，4.6 mm×150 mm（i.d）、ZORBAX Eclipse XDB－C185μm，4.6 mm×150 mm（i.d），Lichrospher C18柱，5μm，4.6 mm×250 mm（i.d），結果表明各種色譜柱均適用，實驗選定ZORBAX Eclipse XDB－C8（4.6 mm×150 mm、5μm）色譜柱。

2.2 流動相的選擇

研究了甲醇－0.15%甲酸和乙腈－0.15%甲酸溶液兩種流動相的色譜分離效果，結果表明乙腈－0.15%甲酸溶液作為流動相效果最好。

2.3 質譜條件的優化選擇

分別采用7種大環內酯類獸藥標準溶液在正離子模式下進行母離子全掃描，再對其子離子進行全掃描，對其質譜條件進行了一系列的優化，確定定性定量離子對，兼顧各成分靈敏度的不同而對離子源條件有所偏重，建立了最佳質譜條件。

2.4 樣品提取溶劑的選擇

大環內酯類獸藥屬于極性物質，易溶于甲醇、乙腈。試驗結果表明，用乙腈、甲醇提取樣品，大環內酯類獸藥的回收率大于70%，兩者沒有顯著差異，考慮到成本和毒性，本文選用甲醇提取方法。

2.5 凈化條件的選擇

試驗了 C18、Oasis（HLB）和 MCX 固相萃取柱對樣品中大環內酯類獸藥殘留的凈化效果。C18和Oasis（HLB）兩種凈化柱效果較好，回收率在70%～110%之間。對MCX小柱，交沙霉素不能洗脫下來。綜合考慮，實驗選定Oasis（HLB）柱，淋洗條件為：5 mL水和5 mL甲醇－水（3+7，V/V）依次洗滌小柱，然后用6 mL甲醇洗脫。

2.6 線性范圍

用7種大環內酯混合標準工作曲線溶液繪制成標準曲線用工作液，按上述色譜和質譜條件測定其峰面積，以質量濃度X（μg/kg）為橫坐標，峰面積的比值Y為縱坐標，繪制7種大環內酯混合標準溶液工作曲線，計算回歸方程和相關系數，見表2。

表2 線性方程Table 2 The linear equation

結果表明，7種大環內酯類藥物濃度與對應的峰面積呈現良好的線性關系，線性范圍：10μg/kg～250μg/kg。

2.7 檢測低限

按所建立的色譜條件，以3倍噪音比作為檢測低限，測得本方法7種大環內酯類藥物的測定低限均為20μg/kg，滿足國內和國際對大環內酯類藥物殘留監控的要求。

2.8 回收率與精密度

以不含大環內酯類藥物殘留的腸衣為空白樣品，分別添加7種大環內酯混合標準溶液,添加濃度為20、100、200μg/kg 3個濃度水平，按照上述方法進行6次重復實驗，測得回收率和精密度，回收率為70.9%～98.4%；相對標準偏差5.8%～17.8%。

腸衣空白樣品和添加濃度為20μg/kg的樣品的LC-MS/MS選擇離子流圖譜圖見圖1～圖2。

保留時間（min）：螺旋霉素（spiramycin）9.26 ，替米考星（tilmicosin）9.63，竹桃霉素（leandomycin）10.01，泰樂菌素（tylosin）10.17，紅霉素（erythromycin）10.11，羅紅霉素（roxithromycin）10.59，交沙霉素（josamycin）11.04。

2.9 樣品檢測

采用上述方法對出口保留的和市場上購買的10個豬腸衣樣品檢驗，結果均為未檢出。

圖1 空白腸衣樣品的選擇離子流圖Fig.1 Selected ion chromatograms of macrolides in blank Pig Casing

3 結論

建立了腸衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂菌素、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素等7種大環內酯類抗生素殘留量的液相色譜-串聯質譜測定方法。試樣用甲醇提取，Oasis（HLB）固相萃取柱凈化，以ZORBAX Eclipse C8（150 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，乙腈-0.15%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，電噴霧、正離子掃描模式分離與檢測7種大環內酯類抗生素殘留量。通過對質譜條件的一系列優化，兼顧各成分的靈敏度，建立了最佳質譜分析條件。7種大環內酯類抗生素的檢出限均為20μg/kg，平均回收率為70.9%～98.4%，相對標準偏差5.8%～17.8%。方法的技術指標滿足國內外對腸衣中大環內酯類抗生素殘留檢測的有關要求。

圖2 添加20μg/kg 7種大環內酯腸衣樣品的選擇離子流圖Fig.2 Selected ion chromatograms of macrolides in spiked Pig Casing(20μg/kg)

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