五子衍宗方對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶及抗氧化損傷的影響＊

王光勇，狄國杰，曾 曉，劉苗苗，何毓敏，袁 丁，張長城，王 婷△

(1.宜昌市夷陵區人民醫院，湖北 宜昌 443100;2.三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443000)

隨著世界人口老齡化程度日益加重，衰老也成為人們備受關注的科學前沿。研究表明，氧化應激學說是衰老的中心學說，該學說認為，正常情況下線粒體有氧呼吸不停地產生自由基副產品(如 O2－、H2O2、OH·等)，但同時機體又具有有效的自由基清除系統(如谷胱甘肽還原系統、超氧化物歧化酶等)，兩者處于動態平衡。隨著年齡的增長，這種平衡逐漸被破壞，造成活性氧(ROS)開始堆積，過量的自由基可通過氧化作用攻擊細胞膜及核酸、蛋白質和酶類等生物大分子，引起細胞膜上的不飽和脂肪酸產生脂質過氧化反應，核酸及蛋白質分子交聯，DNA突變或復制異常及生物酶活力下降，最終導致細胞功能嚴重受損而致衰老［1］。

五子衍宗方是中醫補腎益精的傳統名方，由枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、車前子(鹽炒)組成，具有補腎益精之功效［2］。而中醫的腎虛衰老理論認為，腎主藏精、生髓通于腦，與人體生長發育衰老密切相關，補腎是延緩衰老、防治多種老年病的重要法則。現代藥理研究表明，五子衍宗方具有調節體內性激素水平、改善生殖功能、增強免疫及抗氧自由基損傷等藥理作用［3～5］。因此，本實驗通過皮下連續注射D-半乳糖(D-Gal)建立小鼠衰老模型，研究五子衍宗方對衰老小鼠的學習記憶及抗氧化損傷的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性昆明種小鼠，體重28g～32g，造模前適應性飼養1周，由湖北省實驗動物中心提供(動物生產許可證號SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 藥品與試劑

五子衍宗方組成:枸杞子 400g，菟絲子(炒)400g，覆盆子 200g，五味子(蒸)50g，車前子(鹽炒)100g，購于宜昌市本草堂大藥房。D-半乳糖購于美國Sigma公司，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設備

DT-200跳臺自動測試儀，成都泰盟科技有限公司;MT-200 Morris水迷宮，成都泰盟科技有限公司;JA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠;LDZ5-2型自動平衡離心機，北京醫用離心機廠;WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司;PK-600S型水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

取雄性昆明種小鼠40只，隨機分為對照組、模型組、五子衍宗方低劑量組、五子衍宗方高劑量組4組，每組10只。正常組頸背部皮下注射生理鹽水，其他各組均皮下注射D-半乳糖(150mg/kg/d)進行造模，每天1次。五子衍宗方低、高劑量組分別灌服相應劑量的水提取物 0.49g/kg/d、0.98g/kg/d(分別相當于生藥1.23g/kg/d、2.46g/kg/d)，正常組和模型組灌胃給予等體積的蒸餾水，連續給藥8周。

2.2 Morris水迷宮實驗

造模后第7周開始測試。迷宮水池高50cm，直徑80cm，水池等分成東、西、南、北4個象限，在其中一象限處放一平臺，平臺低于水面1.5cm。每次將小鼠從同一點面向池壁放入水中，先進行定位航行實驗即空間學習訓練，記錄每只動物入水后找到平臺所需時間，即潛伏期，作為學習記憶成績。動物爬上平臺后在上面逗留時間大于2s，就認為找到平臺;若120s內未能找到平臺，成績按120s計，操作者引導動物至平臺并使其在上面逗留2s，定位航行實驗歷時5d。第6天撤除平臺，選擇離原平臺最遠的象限為動物入水點進行空間探索實驗。記錄120s內動物在原平臺所在象限的時間和經過原平臺相應位置的次數，將其作為評價動物學習記憶能力的指標。整個實驗在安靜的房間內進行，水溫控制在22℃ ±0.5℃。

2.3 跳臺實驗

將受試小鼠放入跳臺儀中，適應環境3 min，然后通以36 V交流電。觀察小鼠第1次跳下跳臺的時間，即潛伏期以及5 min內小鼠由高臺跳下受到電擊的次數，即錯誤次數作為學習成績。24 h后重復以上實驗，記錄潛伏期和5 min內錯誤次數，作為記憶成績。測試時若小鼠停留在平臺上超過5 min，其潛伏期以300 s計。

2.4 小鼠臟器指數的測定

處死小鼠后，迅速取出腦、胸腺和脾臟，經生理鹽水洗凈后，用濾紙沾去臟器表面水分稱重，以臟器重量(mg)/體重(g)計算臟器指數。

2.5 小鼠血清中抗氧化酶的測定

小鼠眼球取血分離血清后，分別采用羥胺法和硫代巴比妥酸法檢測血清中SOD活力和MDA含量。測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.6 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據資料用均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗觀察各組間差異。

3 結果

3.1 Morris水迷宮

表1顯示，在空間學習訓練階段，隨著訓練時間的延長，各組小鼠尋找平臺的潛伏期逐漸縮短，說明小鼠獲得了一定的空間記憶能力，且模型組小鼠各天的潛伏期均比對照組延長(P＜0.05或P＜0.01);五子衍宗方高劑量組在第5天的潛伏期比模型組縮短(P＜0.05)。圖1顯示，在空間探索實驗中，模型組小鼠在平臺所在象限(第三象限)的時間比對照組短(P＜0.05)，各給藥組有延長的趨勢;與模型組相比，穿越平臺的次數各給藥組顯著升高(P＜0.05或 P＜0.01)，說明五子衍宗方能改善衰老小鼠的學習記憶能力。

表1 Morris水迷宮中各組小鼠每天潛伏期(±s，，n=10)

表1 Morris水迷宮中各組小鼠每天潛伏期(±s，，n=10)

注:與對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05

組別潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天77±17 68±16 66±16 60±17 65±18模 型 組 108±10##101±11#98±14##89±18# 90±10##五子衍宗方低劑量組 101±33 95±29 86±24 79±19 78±15五子衍宗方高劑量組 94±22 87±17 81±21 77±21 72±16對照組*

圖1 空間探索實驗中各組小鼠停留在各象限的時間和通過平臺次數

3.2 跳臺實驗

表2顯示，模型組與對照組相比出現明顯的學習記憶障礙，跳臺過程中錯誤次數增加，潛伏期縮短。與模型組相比，五子衍宗方對D-半乳糖所致衰老小鼠的學習記憶障礙有改善作用，可減少錯誤次數，延長潛伏期。

3.3 五子衍宗方對D-半乳糖所致衰老小鼠的腦指數、脾臟指數及胸腺指數的影響

表3顯示，與對照組相比，模型組小鼠的腦指數和胸腺指數明顯下降(P＜0.05或 P＜0.01)，與模型組相比，五子衍宗方能增加腦指數和胸腺指數。結果表明五子衍宗方能拮抗D-半乳糖導致的小鼠臟器功能的衰退，提高機體免疫力。

表2 跳臺實驗中各組小鼠的學習記憶成績(±s，n=10)

表2 跳臺實驗中各組小鼠的學習記憶成績(±s，n=10)

注:與對照組比較:#P＜0.05，##P ＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別錯誤次數對照組學習過程 記憶潛伏期(s)錯誤次數 潛伏期(s)37.9±13.9 2.6±1.1 214.2±67.5 0.9±0.6模 型 組 28.5±12.5 4.5±1.2## 127.6±36.1## 2.2±0.8##五子衍宗方低劑量組 34.1±9.0 3.6±1.2 147.6±44.6 1.9±0.6五子衍宗方高劑量組 36.3±12.3 3.0±1.2＊＊ 177.2±57.9＊＊ 1.4±0.5*

表3 各組小鼠腦指數、脾指數、胸腺指數的比較(±s，n=10)

表3 各組小鼠腦指數、脾指數、胸腺指數的比較(±s，n=10)

注:與對照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P ＜ 0.01

組別 腦指數(mg·g－1)脾臟指數(mg·g－1)胸腺指數(mg·g－1)11.9±0.5 3.8±0.9 2.2±0.5模 型 組 9.1±0.4## 4.3±0.6 1.8±0.3#五子衍宗方低劑量組 11.1±1.1＊＊ 4.4±0.5 2.1±0.3＊＊五子衍宗方高劑量組 11.5±0.4＊＊ 4.5±0.8 2.2±0.3對照組＊＊

3.4 五子衍宗方對D-半乳糖致衰老小鼠血清中SOD活力和MDA含量的影響

如表4所示，與正常組相比，模型組小鼠血清中SOD活力明顯下降(P＜0.01)，MDA含量明顯增多(P＜0.01)，五子衍宗方各給藥組能提高衰老小鼠血清中SOD活力 (P＜0.05)，明顯降低衰老小鼠血清中MDA的含量(P＜0.01)。

表4 各組小鼠血清中SOD活力和MDA含量的比較(±s，n=10)

表4 各組小鼠血清中SOD活力和MDA含量的比較(±s，n=10)

注:與對照組比較:##P ＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 SOD活力(U/ml)MDA(nmol/ml)101.0±19.5 8.0±1.0模 型 組 68.1±15.1## 10.6±1.1##五子衍宗方低劑量組 72.3±11.9* 7.9±0.7＊＊五子衍宗方高劑量組 83.9±13.2* 7.8±1.1對照組＊＊

4 討論

D-半乳糖衰老動物模型造模方法簡便易行、價格低廉、結果穩定，已成為國內公認的衰老動物模型，在抗衰老藥物研究等領域得到廣泛應用。當機體細胞內D-gal濃度升高時，會在醛糖還原酶催化作用下還原為半乳糖醇，半乳糖醇不能被細胞進一步代謝，從而在細胞內堆積，影響細胞正常滲透壓，導致細胞腫脹、功能發生障礙和代謝紊亂造成機體衰老［6］。本研究結果表明，小鼠經D-半乳糖連續注射8周后，表現為學習記憶能力下降，抗氧化水平失衡以及腦和胸腺萎縮等病理生理改變。

中醫理論認為，腎主智，腎虛則智不足，認知障礙與腎虛髓空密切相關［7］。五子衍宗方是中醫補腎益精的傳統名方，臨床多用于治療男性不育癥。本實驗結果顯示，五子衍宗方能改善衰老小鼠的學習記憶能力，表現為空間探索能力及記憶能力的增強。

脾臟是外周免疫器官，隨年齡的增長會逐漸萎縮，導致免疫功能減退;胸腺是免疫系統的中樞器官，對維持細胞免疫和調節免疫反應發揮著重要作用。有研究表明，五子衍宗方對免疫低下小鼠的免疫功能有調節作用，對免疫受抑小鼠的特異性及非特異性免疫功能均有明顯促進作用［8，9］。本實驗也表明，五子衍宗方可明顯提高衰老小鼠胸腺指數，說明五子衍宗方具有一定增強衰老模型小鼠免疫功能從而延緩衰老的作用。

研究表明，隨著年齡的增長，機體的抗氧化防御能力逐漸降低，大量的自由基攻擊細胞膜及核酸、蛋白質和酶類等生物大分子，最終導致細胞功能嚴重受損而致衰老。SOD是體內清除自由基的關鍵酶之一，主要存在于胞漿和線粒體中，SOD歧化超氧陰離子為H2O2，在過氧化氫酶的作用下轉化為H2O和氧分子，從而減弱超氧陰離子的氧化損傷。MDA是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而引發的脂質過氧化作用的最終分解產物之一，其含量水平可間接反映了機體內細胞脂質過氧化的程度［10，11］。本實驗中，D-半乳糖致衰老模型小鼠體內的SOD活性顯著降低，MDA含量升高，五子衍宗方能增強小鼠血清中SOD活性，減少MDA的產生，從而改善D-半乳糖所致的氧化損傷發揮抗衰老作用。

綜上所述，五子衍宗方能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的學習記憶能力，同時增強機體的免疫功能，提高機體的抗氧化防御系統發揮抗衰老作用。

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