稀土元素應用于培養高含量DHA螺旋藻的試驗研究*

余紹蕾，鴨 喬，張 瑤，萬慶家

(云南綠A生物工程有限公司，云南昆明 650106)

DHA化學名稱為二十二碳六烯酸，是Ω-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員，是神經系統細胞生長及維持的一種主要元素，俗稱“腦黃金”，具有預防和治療心血管疾病、癌癥和調節中樞神經、視覺系統的功能，對胎兒、嬰兒智力和視力發育尤為重要［1］。目前雖對DHA的研究較多，但富含DHA的天然功能性食品開發還較少，因此，開發富含DHA的天然功能性食品具有重要的社會意義和經濟意義。天然DHA主要來源于魚油、藻類、干果類等。其中，魚油受到產量、純化工藝、氣味等方面的影響，難以廣泛的應用［2］。干果類中所含的α-亞麻酸可在體內轉化為DHA，但轉化效率僅為1%左右，難以被人體利用［3］。藻類中富含 DHA，且易于被人體吸收，是人類補充DHA的一種重要飲食來源。云南綠A生物工程有限公司致力于藻類產品的開發，近年來一直在研究培養富含DHA的螺旋藻，以期開發出富含DHA的螺旋藻類產品，從而擴大螺旋藻的應用范圍，并為社會提供更多、更好的富含DHA的天然功能性食品。

在前期研究中，我們已從諸多的螺旋藻藻種中篩選出了適合我公司螺旋藻養殖基地養殖的富含DHA的螺旋藻藻種:Sp2002，其中DHA含量為7.88‰.為了進一步提高該藻種中DHA的含量，我們繼續對其研究。稀土元素是元素周期表第Ⅲ族副族元素鈧系、釔系和鑭系元素共17種化學元素的合稱，國內外研究報道［4-6］，添加適量的稀土元素，如:鈰 (Ce)、釤 (Sm)、鑭 (La)、釹(Nd)、釔 (Y)、鉺 (Er)等對于部分微藻 (小球藻、隱甲藻等)的生長及其DHA合成具有明顯的促進作用。在此基礎上，我們也進行了在螺旋藻培養過程中添加稀土元素的研究，結果發現，添加適量且適合種類的稀土元素對螺旋藻中DHA含量的提高有促進作用，反之，則有抑制作用，甚至影響螺旋藻的生長。目前，多種稀土元素合用的研究還較少，從理論上說，多種稀土元素聯合使用，可發揮各自不同的作用，促進螺旋藻的生長，但由于稀土元素的特殊性，控制其添加量對于螺旋藻的生長尤為重要。在本次研究中，我們采用正交試驗的方法對幾種已篩選出來的稀土元素聯合應用的用量進行了研究，以期找到更合適培養高含量DHA螺旋藻的試驗條件，為開發出富含DHA的螺旋藻產品作準備。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

螺旋藻Sp2002藻種，螺旋藻培養液由云南綠A生物工程有限公司程海螺旋藻養殖基地提供;LaCl3·7H2O，Nd(NO3)3·6H2O，Ce(NO3)3·6H2O，Sm(NO3)3·6H2O由天津化工生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 螺旋藻的培養

在自然光照條件下通空氣培養至對數生長期，光暗周期12h:12小時。

1.2.2 稀土元素添加量的篩選

以每一種稀土元素作為一個因素，各種稀土元素的不同添加量為水平，設計L9(34)正交試驗。

據文獻報道［6，7］，La3+含量在 5 ～ 20mg/L，Ce3+含量在10mg/L以下，Sm3+含量在10mg/L以下，Nd3+含量在5～20mg/L的條件下對微藻中DHA含量的升高有促進作用。我們在正交試驗設計中選擇各種能夠促進螺旋藻中DHA含量提高的稀土元素添加量進行試驗。正交試驗設計見表1。

表1 稀土元素添加量正交試驗設計

1.2.3 DHA含量的測定

參照國標GB/T5009.168-2003方法進行測定。

(1)樣品處理:取10g螺旋藻干粉，置于60mL分液漏斗中，用60mL正己烷分3次萃取，合并提取液，在70℃水浴上揮至近干，用2～3mL正己烷分兩次將其轉移至10mL具塞比色管中，再加入2mL 2mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，充分震蕩，并于50℃水浴中加熱1～2min，再加入2mL 2mol/L的鹽酸-甲醇溶液，充分震蕩，并于50℃水浴中加熱1～2min，定容至1mL，待上機檢測用。

(2)標準溶液系列:精密稱取DHA 50.0mg，加入正己烷溶解并定容至100mL，制成DHA標準溶液。準確吸取DHA標準溶液1.0，2.0，5.0mL分別移入10mL具塞比色管中，再加入2mol/L的鹽酸-甲醇溶液2mL，充分震蕩，并于50℃水浴中加熱2min，棄去下層液體，再加約2mL蒸餾水洗凈并除去水層，用滴管吸出正己烷層，移至另一裝有無水硫酸鈉的漏斗中脫水，將脫水后的溶液在70℃水浴上加熱濃縮，定容至1mL，待上機測試用。

(3)檢測分析:檢測系統:Agilent 6890氣相色譜儀;FID檢測器;色譜柱:玻璃柱1m×4mm(id)，填充涂有10%DEGS/Chromosorb WDMCS80目～100目的擔體;載氣與流速:氮氣50mL/min，氫氣70mL/min、空氣100mL/min;汽化室溫度:250℃;檢測器溫度:300℃;進樣量:1μl。

1.2.3 對比試驗

采用常規培養方法，即不加稀土元素培養方法和正交試驗確定的試驗方法分別進行3批小試試驗，比較兩種方法培養的螺旋藻中DHA的含量。

2 實驗結果

2.1 正交試驗結果

正交試驗結果及分析見表2。

表2 正交試驗設計結果與分析

從實驗結果可見，在4種稀土元素中，La3+對螺旋藻中DHA含量的提高作用影響最大，Sm3+對其影響最小。由極差分析可知，各因素對螺旋藻中DHA含量的提高作用影響的主次順序為:A＞B＞D＞C，即:La3+＞Ce3+＞Nd3+＞Sm3+。根據正交試驗確定的最佳條件為:A2B1C1D2，即各稀土元素濃度分別為:La3+10mg/L，Ce3+1mg/L，Sm3+2mg/L，Nd3+10mg/L。

2.2 對比試驗結果

在原培養方法的基礎上按La3+10mg/L，Ce3+1mg/L，Sm3+2mg/L，Nd3+10mg/L的劑量添加稀土元素，試驗結果表明，添加稀土元素后，螺旋藻中DHA含量有明顯提高，較原培養方法培養出的螺旋藻中DHA含量提高58.0%，經t檢驗，結果有顯著性差異。比較結果見表3。

表3 對比試驗結果

3 討論

本次研究的結果表明，幾種稀土元素配合使用，對于螺旋藻內DHA含量的升高有明顯的促進作用，其中，在La3+10mg/L，Ce3+1mg/L，Sm3+2mg/L，Nd3+10mg/L的條件下培養，螺旋藻內DHA含量較高。其作用可能是通過以下幾個方面來實現的:①多種低濃度的稀土元素誘導螺旋藻體內形成核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶及其活化酶的復合體，提高CO2的同化效率，促進螺旋藻光合碳同化，從而提高了螺旋藻的光合效率，增加了藻內脂質的積累，從而使DHA含量升高;②稀土元素取代Ca2+作為生物體的第二信使，通過鈣調蛋白參與一系列酶活性調節，參與細胞分裂，連結穩定膜結構中磷脂與蛋白質;③清除藻內自由基，保護藻細胞免受傷害;④稀土元素與蛋白質、酶、多糖和核酸等生物大分子緊密結合，生成配合物，利于脂質和蛋白的積累;⑤稀土元素對某些致病菌起到抑制作用，提高螺旋藻的質量和產量。通過以上途徑，稀土元素促進了螺旋藻的生長和其中營養物質的富集，從而提高其中DHA的含量。目前，對于稀土元素促進螺旋藻內DHA含量升高的作用機理尚不完全明確，還有待于進一步的研究發現;稀土元素用于大規模培養富含DHA的螺旋藻也還有待于進一步的研究，以尋找出最好的大規模培養條件。

［1］郭玉華，李鈺金.水產品中EPA和DHA的研究進展［J］.肉類研究，2011，(1):82-86.

［2］吳忠興，莊惠如，陳堅，等.利用微藻培養生產DHA的研究進展［J］.江西農業大學學報 (自然科學)，2002，24(5):737-740.

［3］李棉棉.DHA知多少［J］.時尚育兒，2011，(10):134-135.

［4］楊革，孔慶娥.鑭與釹對隱甲藻的生長、DHA合成及固氮活性的影響［J］.中國稀土學報，2002，20(12):168-170.

［5］李哲，蔡明剛，黃水英，等.稀土元素Ce對雨生紅球藻生長及蝦青素積累影響的研究［J］.海洋科學，2008，32(9)，37-39.

［6］周正朝，張希彪，上官周平.植物對稀土元素的生理生態響應［J］.西北農業學報，2004，13(2):119-123.

［7］鞠寶，陳永氓，溫少紅.幾種稀土元素對螺旋藻生長的影響［J］.海洋通報，2000，19(4):92-96.