一種果膠酶生產菌株的分離及其產酶條件優化

蘇騰甲，朱雄偉，張佑紅，劉 芬，劉婷婷，徐智鵬，李衛朋

（武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢 430074）

一種果膠酶生產菌株的分離及其產酶條件優化

蘇騰甲，朱雄偉，張佑紅*，劉 芬，劉婷婷，徐智鵬，李衛朋

（武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢 430074）

為了從自然界中尋找一種果膠酶生產菌株，在果膠平板上經過篩選、復篩，分離出產果膠酶生產菌株，并將分離得到的菌株在搖瓶發酵培養、測定其酶活力，其發酵培養基的初始pH、最適溫度、最適接種量及發酵周期進行初步研究.結果表明：經過篩選得到的產果膠酶菌株在發酵培養基的初始pH為7.0、培養溫度為33℃、接種量為30%、發酵周期為56 h時，此菌株產酶的酶活力最高，優化后的條件大大提高了菌株的產酶能力.

果膠酶生產菌株;純化;發酵;產酶條件優化;酶活力

0引言

果膠酶是指分解果膠的一種多酶復合物，通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶，通過它們的聯合作用使果膠質得以完全分解［1］.天然的果膠質在原果膠酶作用下，轉化成水溶性的果膠;果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基團，生成果膠酸;果膠酸經果膠酸水解酶類和果膠酸裂合酶類降解生成半乳糖醛酸，果膠酶廣泛應用于食品工業、飼料工業、造紙工業和紡織工業中［2］.

盡管自然界中天然果膠酶廣泛存在于動植物體內，但其產量較低、難以大規模提取，所以尋求果膠酶的生產方法意義重大.其中，采用微生物發酵的方法，從微生物的代謝產物中提取果膠酶的方法，受到越來越多的關注［3］.本研究從自然界中采樣，篩選出可以產生果膠酶的菌株，經過搖瓶發酵產果膠酶，并通過對發酵條件的優化，使果膠酶的產量得到提高.篩選得到的菌株發酵產生的果膠酶可以直接應用于生物脫膠技術.

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 樣品 從咸寧瑞豐苧麻有限公司3號污水處理池采集土樣.

1.1.2 試劑與儀器 果膠（美國Sigma公司生產），DNS，pH計，電子天平，2001型振蕩慍溫培養

箱，水平離心機，立式壓力蒸汽滅菌鍋，島津紫外UV－1800分光光度計.

1.1.3 培養基 富集培養基：蛋白胨質量分數2.0%，氯化鈉質量分數0.5%，牛肉膏質量分數0.5%，果膠質量分數0.5%，瓊脂質量分數2%;選擇培養基A：果膠質量分數0.5%，蛋白胨質量分數1%，氯化鈉質量分數0.5%，瓊脂質量分數2%;選擇培養基B：磷酸氫二鉀質量分數0.1%，硫酸鎂質量分數0.5%，硝酸鈉質量分數3%，硫酸亞鐵質量分數0.01%，果膠質量分數5%，瓊脂質量分數2%;種子培養基：果膠質量分數0.5%，蛋白胨質量分數1%，氯化鈉質量分數0.5%;發酵培養基：果膠質量分數0.5%，蛋白胨質量分數1%，氯化鈉質量分數0.5%.

1.2 方法

1.2.1 篩選路線 采樣土樣→富集培養→初篩培養→復篩培養→種子罐培養→發酵罐培養→菌種保存.

1.2.2 篩選方法 a.富集培養：將采集到的土樣取樣10 g，放入盛90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩搖約20 min，使土樣與水充分混合，配制成土壤懸液.用一支1 mL無菌吸管吸取1 mL土壤懸液加入到9 mL無菌水的大試管中充分混勻，此為 10－1稀釋液，以此類推配制成 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6幾種稀釋度的土壤溶液.將以上的幾種稀釋度的土壤溶液，分別置于含有富集培養基的平板中進行培養.35℃培養1～2 d，進行多次富集培養，篩選出生長良好的菌株［3］.

b.初篩培養：取在富集培養基生長良好的菌株，用無菌水稀釋后涂布于選擇培養基 A中，35℃培養1～2 d，選取生長良好的菌株，進行復篩培養.

c.復篩培養：取在選擇性培養基A生長良好的菌株，用無菌水稀釋后涂布于選擇培養基B中，35℃培養1～2 d，選取生長良好的菌株，并進行多次復篩培養，篩選出優良菌株.

d.種子罐培養：經過復篩得到的菌株，置于250 mL搖瓶中35℃培養2～3 d，搖床轉速為120 r/min.種子罐培養的目的是使菌種量最大化，進而有足夠的菌種進行發酵罐培養.

e.發酵罐培養：種子罐得到的菌種液按8%的菌種量接種于發酵培養基中，進行菌株的發酵培養.

1.2.3 酶活力的測定 a.葡萄糖標準曲線的繪制：采用標準曲線法，配制已知濃度的標準葡萄糖溶液，用分光光度計在540 nm處測定其吸光度，以吸光度（A）為橫坐標、每毫升溶液葡萄糖毫克數（C）為縱坐標，作A與C標準曲線.

b.菌株發酵液中酶液的提?。喝∵m量發酵液置于15 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，上清液即為酶液.

c.酶活力的測定：取一個15 mL離心管加入l% 的果膠溶液1.0 mL，50℃預熱3 min、加酶液0.2 mL、混合、50 ℃ 水解 10 min，加 DNS 試劑3 mL，混合后于沸水浴中10 min，冷卻定容至15 mL，并用等量的發酵培養基0.2 mL空白調零，540 nm下測定吸光度值.

酶活力E=（194/180×C×1 000）/（0.2×10）

通過測定上述發酵上清液對果膠的降解液的吸光度A，再由葡萄糖標準曲線得到標準方程，得到果膠酶分解果膠得到的半乳糖醛酸的量經過換算得到的葡萄糖的量C.

194/180為葡萄糖換算成半乳糖醛酸的量.

在以上測定條件下，1 min水解果膠產生1 μg還原糖（以半乳糖醛酸計），所需酶量定義為1個酶活力單位（U）.

d.產酶條件的研究：將篩選得到的產果膠酶菌株進行發酵培養，并對其發酵培養基的初始pH、培養溫度、接種量和發酵周期的研究，從而可以得到使此菌株產果膠酶的最佳產酶培養條件.

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖量與吸光度的關系曲線：橫坐標為每毫升溶液葡萄糖毫克數（mg/mL），縱坐標為吸光度（A）.如圖1所示.

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 酶活力測定

經搖瓶發酵得到的酶液測定其吸光度A0，相對應的半乳糖醛酸量G，經過計算得到的酶活力E.如表1所示.

表1 酶液的吸光度A0、半乳糖醛酸量G和酶活力E Table 1 Absorbance A0，galactose uronic acid amount G，enzyme activity E of pectinase

由表1結果表明經過篩選得到的菌株有產果膠酶的能力，此菌株呈梭形短桿狀，菌落邊緣光滑，為革蘭氏陰性，屬細菌類.

2.3 產果膠菌株發酵培養條件的優化

2.3.1 發酵培養基初始pH對產酶的影響 在培養時間48 h、培養溫度30℃、接種量相同的條件下，轉速為120 r/min時，測定不同發酵培養基初始pH對菌株產果膠酶的酶活力變化.由圖2可知，發酵培養基初始pH為7.0左右，即中性pH條件下，菌株產酶效率高.pH值可以影響發酵培養基中某些成分解離，同時也影響著酶的活性，pH過高或者過低都會影響酶的產量.

圖2 發酵培養基初始pH對產酶的影響Fig.2 Effect of fermentation medium initial pH on enzyme producing

2.3.2 培養溫度對酶活力的影響 在發酵培養基初始pH為7.0、轉速12 r/min、接種量相同的情況下，培養48 h時，測定不同培養溫度對菌株產果膠酶的酶活力變化，見圖3.

圖3 培養溫度對發酵的影響Fig.3 Effect of culture temperature on enzyme producing

如圖3所示，菌株培養溫度在33℃左右時，菌株產酶效率高.溫度過高或過低，都會影響酶活力，溫度影響著菌株的繁殖和酶的產量.

2.3.3 接種量對產酶的影響 在發酵培養基初始pH為7.0、培養溫度30℃、轉速120 r/min、培養48 h的條件下，控制接種量為平時的10%，20%，30%，40%，50%，60%測定菌株的產酶效果變化，見圖4.

圖4 接種量對產酶的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on enzyme producing

如圖4所示，接種量為平時接種量的40%時，酶活力達到最高.接種量過低，菌株的生長時間較長，酶活較低;接種量過大時，造成短時間積累大量次級代謝產物而影響產酶效果.

2.3.4 發酵培養周期對產酶的影響 在發酵培養基初始 pH為 7.0、培養溫度 30℃、轉速120 r/min、接種量相同的條件下，調節菌株發酵周期的時間，測定菌株的產酶效果變化.

如圖5所示，菌株的發酵周期為56 h左右時，果膠酶的酶活力達到最大.發酵周期短，酶可能沒有最大化分泌到細胞外，從而使酶活力較低;發酵周期過長時，積累大量次級代謝產物而影響產酶效果，甚至會影響已經產生的酶的活性.

圖5 發酵周期對產酶的影響Fig.5 Effect of fermentation period on enzyme producing

3結論

通過從苧麻池的厭氧池中采樣，經過馴化篩選，得到了一種菌株，通過研究此菌株，證明其有產果膠酶的能力，為革蘭氏陰性細菌;通過對菌株發酵培養基初始pH、最適溫度、最適接種量和最佳發酵周期的實驗研究.結果表明，此菌株的最佳發酵條件為發酵培養基初始pH為7.0、最適培養溫度33℃、最適接種量為平時接種量的40%、最佳的發酵周期為56 h.

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Separation of one pectinase strain and optimization for it’s production of enzymes

SU Teng-jia，ZHU Xiong-wei，ZHANG You-hong，LIU Fen，LIU Ting-ting，XU Zhi-peng，LI Wei-peng
（Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education，School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China）

A pectinase strain from the nature would was screened and rescreened on the culture dishes，and cultivated in the shake flask for fermentation.The enzyme activity of pectinase strain was also detected in the cultivation process.The initial pH value of fermentation medium，fermentation temperature，optimum innoculation amount and the fermentation period were studied preliminarily.The results show that the pectinase strain has the best enzyme activity when the initial pH value of fermentation medium is 7.0，the culture temperature is 33 ℃，the innoculation amount is 30%and fermentation period is 56 h.The optimized conditions can greatly improve the enzyme activity.

pectinase strain;purification;fermentation optimization for enzyme production;enzyme activity

Q93－33

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2012.04.004

1674-2869（2012）04-0015-04

2012-03-15

蘇騰甲（1989－），男，安徽宣城人，碩士研究生.研究方向：生物工程與技術.

指導老師：張佑紅，男，教授，博士，博士研究生導師.研究方向：生物技術.*通信聯系人

張 瑞