LC-MS法測定人尿液中依非巴特的濃度Δ

周志凌 ，楊 敏 ，余細(xì)勇 ，單志新 ，林秋雄 ，麥麗萍，鄧春玉 ，張夢珍，陳鐵峰 ，劉曉穎，陳秀云，林曙光

（1.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)科院醫(yī)學(xué)研究中心，廣州510080；2.廣東省心血管病研究所，廣州 510080；3.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)科院藥學(xué)部，廣州 510080）

LC-MS法測定人尿液中依非巴特的濃度Δ

周志凌1，2＊，楊 敏2，3#a，余細(xì)勇1，2#b，單志新1，2，林秋雄1，2，麥麗萍1，2，鄧春玉1，2，張夢珍1，2，陳鐵峰1，2，劉曉穎1，2，陳秀云1，2，林曙光1，2

（1.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)科院醫(yī)學(xué)研究中心，廣州510080；2.廣東省心血管病研究所，廣州 510080；3.廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)科院藥學(xué)部，廣州 510080）

目的：建立測定人尿液中依非巴特濃度的方法。方法：尿液樣品經(jīng)蛋白沉淀后，采用液-質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)樣測定，以甲醇-0.008 mol·L－1甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）（35∶65）為流動相，Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18為色譜柱進(jìn)行分離；采用電噴霧電離源，以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式進(jìn)行正離子檢測，用于定量分析的離子對依非巴特為m/z 832.6→m/z 646.4，內(nèi)標(biāo)為m/z 931.6→m/z 745.6。結(jié)果：依非巴特尿藥濃度在5.0～5 000.0 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 6），最低定量限（LLOQ）為5.0 ng·mL－1；日內(nèi)和日間RSD均＜7%，方法回收率為99.4%～103.1%，絕對回收率≥93%。結(jié)論：本方法選擇性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，能快速、準(zhǔn)確測定人尿液中依非巴特的濃度，并且成功用于依非巴特尿藥排泄的研究。

依非巴特；液-質(zhì)聯(lián)用法；尿液濃度；藥動學(xué)

依非巴特（Eptifibatide）的化學(xué)結(jié)構(gòu)是一種環(huán)形肽，它是特異性的GPⅡb/Ⅲa受體拮抗藥，通過阻止纖維原與GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集和防止血栓形成，在急性冠脈綜合征患者中呈劑量依賴性地抑制體外血小板的聚集，在健康志愿者和行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）術(shù)的患者中能抑制纖維原與二磷酸腺苷活化的血小板結(jié)合。臨床上依非巴特常作為肝素或阿司匹林的輔助藥[1，2]。注射用依非巴特的新藥注冊分類為化藥3.1類，需研究依非巴特在健康中國人群的藥動學(xué)及尿藥排泄情況。目前有文獻(xiàn)采用反相高效液相色譜法分離純化合成的依非巴特[3]，另外有文獻(xiàn)報(bào)道采用液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法檢測血漿中依非巴特的濃度[4]，然而目前未見有測定尿液中依非巴特濃度的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文旨在建立一種靈敏、快速、特異性好的LC-MS法測定人尿液中依非巴特的濃度。此方法成功地應(yīng)用于注射用依非巴特的尿藥排泄研究。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括DGU-20A3型在線脫氣系統(tǒng)、LC-20AD型二元泵、20AC自動進(jìn)樣器、CTO-20AC型柱溫箱（日本Shimadzu公司）；API 4000 Qtrap三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，電噴霧電離源（ESI）以及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國AB Sciex公司）；Beckman GS-6R離心機(jī)和Beckman-Coulter AllegraTM64R冷凍高速離心機(jī)（美國Beckman公司）；Glas-Col數(shù)字脈沖旋渦混合儀（美國Glas-Col公司）；BP110S型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

醋酸依非巴特對照品（海南雙成藥業(yè)股份有限公司，批號：081101，含量：97%）；內(nèi)標(biāo)：EPM-05（深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司，含量：98%）；甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸均為色譜純；水為重蒸去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5μm）和預(yù)柱C18柱（12.5 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.008 mol·L－1甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-甲醇（65∶35），用0.45μm濾膜過濾；流速：0.5 mL·min－1；柱溫：30℃；自動進(jìn)樣器溫度：10℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI源），正離子方式檢測，用于定量分析的離子對依非巴特為m/z 832.6→m/z 646.4（裂解能量（CE）為57 V），內(nèi)標(biāo)為m/z 931.6→m/z 745.6（CE為62 V）；解簇電壓（DP）：145 V；掃描時(shí)間：200 ms；入口電壓（EP）：10 V；出口電壓（CXP）：10 V：氣簾氣（CUR）：20 psi；碰撞氣（CAD）：中度；源電壓（IS）：5 500 V；源溫度（TEM）：400℃；霧化氣（GS1）：55 psi；加熱輔助氣（GS2）：65 psi。在選定的質(zhì)譜條件下，依非巴特和內(nèi)標(biāo)主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，分別為m/z 832.6和931.6。選擇性對[M+H]+進(jìn)行MS2產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析，分別選擇碎片m/z 646.4和745.6作為依非巴特和內(nèi)標(biāo)的MRM監(jiān)測離子（見圖1）。

圖1 MS2質(zhì)譜圖A.依非巴特；B.EPM-05Fig 1 MS2 massspectraA.eptifibatide；B.EPM-05

2.3 對照品溶液配制

分別配置濃度為1.0 mg·mL－1的依非巴特甲醇貯備液和0.5 mg·mL－1的內(nèi)標(biāo)甲醇貯備液，于－20℃保存。將1.0 mg·mL－1依非巴特貯備液用50%甲醇配成質(zhì)量濃度為50μg·mL－1的工作液，將0.5 mg·mL－1內(nèi)標(biāo)貯備液用甲醇配成質(zhì)量濃度為400 ng·mL－1的工作液。

2.4 尿液樣品處理

取含藥尿樣0.30 mL置于1.5 mL的錐形離心管中，加入400 ng·mL－1的內(nèi)標(biāo)甲醇溶液200μL，快速振蕩5 s，10 000 r·min－1，離心5 min，取上清液10μL進(jìn)行LC-MS法分析。

2.5 方法學(xué)選擇性考察

分別取6名受試者空白尿液考察方法的選擇性，結(jié)果表明內(nèi)源性雜質(zhì)無干擾，內(nèi)標(biāo)響應(yīng)穩(wěn)定。空白尿樣、空白尿樣+依非巴特對照品溶液+內(nèi)標(biāo)溶液、受試者尿液樣品色譜見圖2。

圖2 典型色譜圖A.空白尿樣；B.空白尿樣+依非巴特（200 ng·mL－1）對照品溶液+EPM-05（內(nèi)標(biāo)，266.7 ng·mL－1）溶液；C.溶液受試者服藥6～9 h對照品溶液尿藥樣品（285 ng·mL－1）；Ⅰ.依非巴特；Ⅱ.EPM-05Fig 2 Typical chromatogramsA.blank urine；B.blank urine+eptifibatide（200 ng·mL－1）control+EPM-05（IS，266.7 ng·mL－1）；C.urine sample of volunteers6～9 h after medication（285 ng·mL－1）；Ⅰ.eptifibatide；Ⅱ.EPM-05

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和定量下限考察

先以50μg·mL－1的依非巴特工作液配成濃度為5 000.0 ng·mL－1的依非巴特尿樣品，然后以空白尿?qū)⑵渲鸩较♂尦蓾舛确謩e為5.0、20.0、100.0、500.0、2 000.0μg·L－1的尿液樣品。樣品處理后，經(jīng)LC-MS分析，以依非巴特峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，尿中依非巴特濃度（X）為橫坐標(biāo)，得典型線性代表方程為：Y＝0.003 62X+0.001 13（r＝0.999 6，n＝6，權(quán)重系數(shù)為1/X2）。結(jié)果表明，依非巴特尿藥濃度在5.0～5 000.0 ng·mL－1范圍呈良好的線性關(guān)系，依非巴特最低定量限（LLOQ）為5.0 ng·mL－1（信噪比S/N＞9）。平行對5個濃度為5.0 ng·mL－1的含藥尿樣處理后進(jìn)行分析，其準(zhǔn)確性平均為107%，RSD為6.9%，說明該方法具有很好的靈敏度。

2.7 精密度和準(zhǔn)確度

按照“2.6”項(xiàng)下方法配制成低、中、高（10.0、200.0、4 000.0 ng·mL－1）3種濃度的依非巴特尿樣質(zhì)控樣品各5份，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控樣品測得的濃度進(jìn)行方差分析，考察日內(nèi)和日間精密度及方法回收率（準(zhǔn)確度），結(jié)果見表1。

表1 精密度及方法回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Resultsof precision and recovery tests

2.8 絕對回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性考察

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，通過比較3個不同條件下信號峰面積的平均值來考察基質(zhì)效應(yīng)和絕對回收率。其中，條件（Set）1：純的對照品溶液；Set2：不同個體的空白尿樣沉淀蛋白后再添加依非巴特或內(nèi)標(biāo)；Set3：不同個體的空白尿樣沉淀蛋白前添加依非巴特或內(nèi)標(biāo)。則基質(zhì)效應(yīng)（ME）＝Set2/Set1，絕對回收率＝Set3/Set1。依非巴特采用低（10.0 ng·mL－1）、中（200.0 ng·mL－1）、高（4 000.0 ng·mL－1）3個濃度點(diǎn)，內(nèi)標(biāo)采用1個濃度點(diǎn)（267 ng·mL－1），各條件下重復(fù)測定5個樣品。結(jié)果，低、中、高濃度的依非巴特和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)分別為99%、92%、96%和109%，可見尿介質(zhì)對低、中、高3種濃度藥物的測定影響程度基本一致；絕對回收率分別為96%、98%、93%和107%。

分別考察了依非巴特低、中、高（10.0、200.0、4 000.0 ng·mL－1）3種濃度的尿液質(zhì)控樣品室溫放置24 h、反復(fù)凍融3次、－20℃凍存5個月以及經(jīng)預(yù)處理后置于10℃自動進(jìn)樣器24 h的穩(wěn)定性。每個濃度5份樣品，則穩(wěn)定性＝（測定值/理論值）×100%。結(jié)果表明，依非巴特低、中、高尿液質(zhì)控樣品在各條件下穩(wěn)定，穩(wěn)定性介于90.2%～108.2%之間。

2.9 樣品采集及測定結(jié)果

經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并簽訂知情同意書后，10名健康志愿者經(jīng)篩選入組接受靜脈推注注射用依非巴特90μg·kg－1，收集給藥前和給藥后0～2、2～4、4～6、6～9、9～12、12～16、16～24 h的尿液，每時(shí)間段測量尿液總體積，并充分混合后留取5 mL尿液于－20℃冰箱貯存?zhèn)錅y。臨床實(shí)際尿液樣品測定按前述方法操作，每個分析批隨行1條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)制備低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度至少雙樣本，并且質(zhì)控樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%，使質(zhì)控均勻分布在未知樣品測試順序中。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求算未知實(shí)際樣品濃度和質(zhì)控樣品濃度。質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差應(yīng)＜15%，低濃度點(diǎn)偏差應(yīng)＜20%。最多允許1/3的質(zhì)控樣品結(jié)果超限，但不能出現(xiàn)在同一濃度質(zhì)控樣品中，否則當(dāng)日數(shù)據(jù)不可接受。濃度超過定量上限的尿液樣品，將樣品以空白尿液稀釋后重新測定。用建立的方法分析了采集的尿樣，結(jié)果表明該方法能檢測到所有待分析樣品中依非巴特的濃度。健康受試者靜脈推注依非巴特（90μg·kg－1）后尿液中依非巴特濃度見表2。

3 討論

依非巴特和內(nèi)標(biāo)分子結(jié)構(gòu)上既有銨基又有羧基，因此本試驗(yàn)考察了正負(fù)離子檢測模式以及不同溶劑種類的影響，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，甲醇-甲酸銨-甲酸緩沖液有更好的響應(yīng)，依非巴特和內(nèi)標(biāo)主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，分別為m/z 832.6和931.6。選擇性對[M+H]+進(jìn)行MS2產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析，依非巴特和內(nèi)標(biāo)均產(chǎn)生了較多的碎片離子，經(jīng)過優(yōu)化比較后，分別選擇了穩(wěn)定性好和靈敏度較高的碎片m/z 646.4和745.6作為依非巴特和內(nèi)標(biāo)的MRM監(jiān)測離子。

表2 健康受試者靜脈推注依非巴特（90μg·kg－1）后尿液中依非巴特濃度Tab 2 Urine concentrations of eptifibatide in healthy subjects receiving i.v.administration of eptifibatide（90μg·kg－1）

[1]Coller BS，Anderson KM，Weisman HF.The anti-GPⅡb-Ⅲa agents：fundamental and clinical aspects[J].Haemostasis，1996，26（Suppl 4）：285.

[2] Phillips DR，Teng W，Arfsten A，et al.Effect of Ca2+on GPⅡb-Ⅲa interactions with integrilin：enhanced GPⅡb-Ⅲa binding and inhibition of platelet aggregation by reductions in the concentration of ionized calcium in plasma anticoagulated with citrate[J].Circulation，1997，96（5）：1 488.

[3] 熊 瑛，王 宇，陳 亮.Eptifibatide的固相合成及分離純化[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，46（1）：100.

[4] Liu J，Duan X，Chen X，et al.Determination of eptifibatide concentration in human plasma utilizing the liquid chromatography-tandem mass spectrometry method[J].J Chromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci，2009，877（5-6）：527.

[5]Matuszewski BK，Constanzer ML，Chavez-Eng CM.Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J].Anal Chem，2003，75（13）：3 019.

Determination of Eptifibatide Concentration in Human Urine by LC-MS

ZHOU Zhi-ling，YU Xi-yong，SHAN Zhi-xin，LIN Qiu-xiong，MAI Li-ping，DENG Chun-yu，ZHANG Meng-zhen，CHEN Tie-feng，LIU Xiao-ying，CHEN Xiu-yun，LIN Shu-guang
（Medical Research Center，Guangdong Provincial People’s Hospital&Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China）
ZHOU Zhi-ling，YANG Min，YU Xi-yong，SHAN Zhi-xin，LIN Qiu-xiong，MAI Li-ping，DENG Chun-yu，ZHANG Meng-zhen，CHEN Tie-feng，LIU Xiao-ying，CHEN Xiu-yun，LIN Shu-guang
（Guangdong Provincial Cardiovascular Institute，Guangzhou 510080，China）
YANG Min
（Dept.of Pharmacy，Guangdong Provincial People’s Hospital&Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the determination of eptifibatide in human urine.METHODS：Following protein precipitation，LC-MS method was adopted.The determination was performed on a Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-0.008 mol·L－1ammonium formate（containing 0.1%formic acid）（35∶65）.Electrospray ionization source was used as detector and operated in the positive ion mode.Quantification was performed using multiple reaction monitoring（MRM）of the transitions m/z of 832.6→646.4 and 931.6→745.6 for eptifibatide and internal standard，respectively.RESULTS：The linear range was 5.0～5 000.0 ng·mL－1for eptifibatide（r＝0.999 6）with the LLOQ of 5.0 ng·mL－1.The intra-day and inter-day RSDs were less than 7%.Method recoveries were 99.4%～103.1%and absolute recovery was no less than 93%.CONCLUSION：The method is selective，sensitive，reproducible，rapid and accurate for the determination of eptifibatide in human urine and study of eptifibatide excretion.

Eptifibatide；LC-MS；Urine concentration；Pharmacokinetics

R969.3；R978.1；R287

A

1001-0408（2012）46-4350-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.46.11

Δ廣東省自然科學(xué)基金（9151064101000063）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)課題（A2011004）

＊副研究員，碩士。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：020-83827812-51157。E-mail：chowzl@yahoo.com.cn

#a通訊作者：主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：020-83827812-60239。E-mail：mnmyang@yahoo.com.cn

#b通訊作者：研究員，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：臨床藥理學(xué)。電話：020-83827812-51155。E-mail：xiyongyu@gmail.com

2012-04-28

2012-08-29）