腎消康對糖尿病大鼠腎組織基因Gna12表達的影響*

喬 羽，解 穎，白玉賓，王 兵，陳 飛，劉春紅，柳成剛，常佳怡，高恩宇，韓潔茹，姜德友

（黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱 150040）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病的一種嚴重的微血管并發癥，其主要病理改變為腎小球肥大，基底膜增厚，以及系膜區基質增加，導致彌漫性或結節性腎小球硬化。臨床上早期表現為尿中排出微量白蛋白，繼之出現臨床蛋白尿，最后進展為慢性腎功能不全。近年來隨著其發病率和病死率的提高，DN嚴重地威脅著人類的健康，影響患者的生存質量，因此，對DN的研究已成為世界性醫學攻關課題。由于該病的發病機制較復雜，臨床尚無理想藥物，而中醫藥在防治DN方面頗具優勢，為此筆者借助分子生物學研究方法，采用基因芯片技術，利用目前國際學術界公認的美國Affymetrix公司生產的Rat2302.0基因表達譜芯片，首先進行差異基因篩選，然后進一步用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應法（RT-PCR）檢測，尋找DN相關基因，探討DN病變機制，篩選藥效靶點，闡釋中藥復方腎消康治療DN的作用機制，為此筆者對鏈脲佐菌素（STZ）誘導DN大鼠的腎臟基因表達譜進行了研究。本文僅報告腎消康對DN大鼠腎臟組織基因鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α12（Gna12）表達的影響。

1 基因芯片實驗

1.1 主要試劑、藥品和儀器 鏈脲佐菌素（STZ）為Calbiochem公司產品；腎消康制成浸膏，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室制備，-20℃的冰箱保存，使用前加溫至37℃。有關芯片檢測試劑及儀器，均為上海生物芯片有限公司制備，包括Affymetrix Genechip Scanner2.0、Affymetrix Fluidics Station450、Affymetrix Genechip Hybridization Oven640等。

1.2 動物造模及分組 Wistar大鼠120只，雄性，體質量180～210 g（由哈爾濱醫科大學實驗中心提供），合格證號：P00102004，分籠飼養，每籠飼養7只，室溫（18±2）℃，相對濕度 50%～60%，通風良好，每日光照12 h，自由攝食、飲水。適應性喂養1周后，隨機選取10只作為空白對照組，以普通飼料喂養，經左下腹注射檸檬酸緩沖液25 mg/kg（pH 4.4），其余大鼠稱質量，以25 mg/kg STZ左下腹腔注射，每日上午注射1次，連續5 d。注射前12 h禁食，不禁水。注射后1 h，大鼠自由飲水、進食。造模1周后測血糖。血糖值在16.7 mmol以上的大鼠共50只，再隨機分為模型組、西藥對照組、腎消康高、中、低治療組，各組均10只。各組均喂以高熱量飼料（1%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、1%蔗糖、78%為基礎飼料）19周，繼續喂養普通飼料7周，共喂養26周。

1.3 給藥方法 喂養高熱量飼料19周后，隨機抽取各組大鼠進行病理檢測，光鏡、電鏡下病理檢測近似人類糖尿病慢性腎組織損傷的病理變化。空腹稱質量，按大鼠的體表面積與成人劑量之間的換算關系計算給藥量。腎消康治療組給藥量為0.79 g/mL，每200 g體質量每次給藥2 mL，每日灌胃1次，空白組、模型組以等量生理鹽水灌胃。

1.4 標本采集 以電子秤稱取每只大鼠體質量，禁食、水12 h，摘眼球取血，分裝不同試管，4℃保存備檢，以測肌酐、尿素氮等指標。乙醚麻醉后，常規固定、消毒、鋪布等處理，沿正中線切開腹壁，快速用180℃、12 h處理過的手術剪刀摘取腎臟、稱質量，立即用預冷的生理鹽水沖洗，沖洗后在冰上操作。將右腎置于4%多聚甲醛固定，供光鏡觀察及免疫組化實驗使用；將1/3左腎置于2.5%戊二醛中固定，以備制做電鏡；將其余2/3左腎置于液氮中凍存以備提取核糖核酸（RNA）使用。

1.5 統計方法 采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

1.6 DN大鼠腎臟損傷的生化指標及病理變化

1.6.1 血肌酐、血尿素氮的變化 模型組血尿素氮（BUN）水平明顯升高，與空白組比較差異具有統計學意義（P<0.01），各治療組較模型組有較大幅度降低（P<0.01），其中西藥對照組、腎消康高劑量組和中劑量組（P<0.01），腎消康低劑量組（P<0.05），各治療組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；血肌酐（SCr）模型組水平明顯升高，與空白組比較差異具有統計學意義（P<0.01），各治療組較模型組有較大幅度降低（P<0.01），各治療組組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。說明腎消康可使血肌酐、血尿素氮的生化指標降低。

表1 各組血清 Scr、BUN 水平比較（n=10，±s）Tab.1 Comparison of serum levels of Scr and BUN in three groups（n=10，±s）

表1 各組血清 Scr、BUN 水平比較（n=10，±s）Tab.1 Comparison of serum levels of Scr and BUN in three groups（n=10，±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別Scr（μmol/L）BUN(mmol/L)空白組 107.19±13.216.33±1.14模型組 162.66±17.06** 15.78±3.95**西藥對照組 133.74±16.7## 11.34±2.26##高劑量組 128.80±18.66## 10.95±0.97##中劑量組 121.44±22.48## 10.52±2.17##低劑量組 123.9±21.37## 11.78±3.35#

1.6.2 尿微量白蛋白、β2-微球蛋白的變化 模型組大鼠尿微量白蛋白（Alb）、β2-微球蛋白（β2-MG）排泄量明顯高于空白組（P<0.01），治療組與模型組比較，尿微量白蛋白、β2-微球蛋白排泄量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）。提示腎小球和腎小管的結構和功能受損，腎消康能降低尿微量白蛋白、β2-微球蛋白排出量，說明其對腎臟結構及功能有較好的保護作用。

表2 各組 24 h Alb，β2-MG 水平比較（n=10，±s）Tab.2 Comparison of Alb and β2-MG levels during 24 h in three groups（n=10，±s）

表2 各組 24 h Alb，β2-MG 水平比較（n=10，±s）Tab.2 Comparison of Alb and β2-MG levels during 24 h in three groups（n=10，±s）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 Alb（mg/24 h）β2-MG（mg/24 h）空白組 25.68±4.321.47±0.25模型組 70.96±9.52** 3.95±0.78**西藥對照組 40.25±9.83## 2.62±0.79##高劑量組 36.04±8.80## 2.55±0.70##中劑量組 32.56±8.01## 2.45±0.86##低劑量組 33.52±7.86## 2.51±0.52##

1.6.3 腎臟組織病理及超微結構變化 光鏡下觀察，空白組：大鼠腎小球毛細血管基底膜厚薄均勻。近曲小管的上皮細胞較少，胞漿，管腔狹窄而不規則；遠曲小管上皮細胞較多，胞漿伊紅淡染，管腔寬而規則，見圖1。模型組：腎小球系膜細胞增生，基質堆積明顯，腎小球肥大，腎小球基底膜增厚，發生透明樣改變，腎小球與囊壁粘連（滲出性腎小球硬化），小球分葉、分瓣明顯（彌漫性腎小球硬化），趨向纖維化，見圖2、圖3。腎消康中劑量組：少數腎小球輕微的基底膜增厚，輕微的透明樣變，部分腎小球囊壁增厚，少數腎小球粘連、有分葉狀，有少數纖維增生，少數有局部系膜基質增生及輕度的腎小管擴張和上皮細胞脫落，見圖4。

電鏡下觀察，空白組：近端小管上皮細胞微絨毛密集，胞質內可見大量圓桿狀線粒體和少量溶酶體，游離蛋白豐富，高爾基復合體、粗面內質網發達。遠端小管上皮細胞結構正常，細胞器形態清晰，系膜細胞完好，見圖5。模型組：腎小球基膜增厚，足細胞壞死，濾孔膜溶解，血管內皮細胞質呈網狀排列。近端腎小管上皮微絨毛溶解脫落，細胞間連接消失。胞質內溶酶體數量增多，線粒體絮狀變。遠端小管壞死的細胞質膜脫落，質膜內褶區可見較多的小空泡，見圖6、圖7。腎消康中劑量組：腎小球毛細血管內皮清晰可見，濾孔膜柵欄狀排列，足細胞核清晰，部分核呈凋亡狀。近端小管微絨毛脫失、溶解，胞質內有大量的溶酶體，游離核蛋白體豐富。間質血管內皮功能活躍，細胞器數量增多，見圖8。

圖6 模型組腎臟（電鏡 ×6000）Fig.6 Kidneyofmodelgroup(electron microscope×6000)

圖5 空白組腎臟（電鏡 ×6000）Fig.5 Kidney of blank group(electron microscope×6000)

圖7 模型組腎臟（電鏡 ×6000）Fig.7 Kidney of model group(electron microscope×6000)

圖8 腎消康中劑量組腎臟（電鏡 ×6000）Fig.8 Kidney of Shenxiaokang middle dose group(electron microscope×6000)

1.7 基因芯片實驗方法 從各組大鼠中取腎臟，使用QIAGEN RNA Isolation Kit抽提總RNA，由純化的總RNA合成雙鏈cDNA，經PLG提取、乙醇沉淀將雙鏈互補脫氧核糖核酸（cDNA）純化，用Bio Array High Yield RNA Transcript Labeling Kit方法以生物素標記互補核糖核酸（cRNA）合成，QIAGEN Rneasy Columns法體外轉錄純化生物素標記的cRNA，用分光光度計分析RNA濃度進行質控，凝膠電泳檢測產物，片斷化cRNA，合成cRNA探針。合成好的cRNA探針經片段化處理后用于與基因芯片雜交。芯片的雜交、洗脫、染色及檢測利用Affymetrix公司生產的專用設備“基因芯片檢測工作站”進行，一切操作過程均按Affymetrix公司推薦的條件進行。

1.8 基因芯片檢測數據的處理 芯片掃描所得數據應用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”進行數據處理。

1.9 基因芯片篩選結果按照比較嚴格的條件篩選出差異表達基因，表達差異2倍以上的基因列表，包括基因名稱、GenBank號、Uni號和染色體定位。其中，NM_03 段落tr.1：Gna12即是篩選出的差異表達基因之一，在DN大鼠腎臟組織表達下調，經腎消康治療后表達上調，見圖9。

灰度掃描圖中采用芯片圖像分析軟件分析芯片灰度掃描圖，得到芯片上每個基因點的原始信號值（包括前景信號值和背景信號值），從而進行差異表達基因的判定。散點圖中X軸為對照組信號值，Y軸為實驗組信號值，圖中紅色點為實驗組和對照組該基因的Detection均為P，藍色為兩組中有一個值不是P，而黃色為兩組均為A。這些點在Affymetrix公司的MASS5.0軟件中可以顯示Probe Set ID。

2 實時熒光定量RT-PCR的實驗檢測

2.1 主要實驗儀器 PCR儀，PTC-225 Peltier Thermalcycler， MJ Research Inc.，Waltham，Massachusetts；熒光定量PCR儀，Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler，Corbett Reseach，Sydney，Australia。

DN大鼠腎組織 Gna12的 sense primer、antisense primer、product值如下：sense primer：5’-GGAGAAGGTGAAGTCGGTGAGC-3’，length：22 bp，Tm值：60.30℃。anti-senseprimer：5’-GGCAGTGGTGAAGTGGTGGAAC-3’，length：22 bp，Tm 值：61.30℃。product length:154 bp,product Tm值：92.50℃。

2.2 實驗方法 本實驗采用Eve green法，使用TAKARA公司的RNA PCR kit反轉錄試劑盒,按照試劑盒提供的反應體系進行反轉錄反應。反轉錄體系 10 μL，30℃反應 10 min，42 ℃反應 30～50 min，95℃加熱5 min，4℃反應5 min中止。

利用TAKAR公司的TaKaRa Ex Taq Rt-PCR Version.2.1進行熒光定量PCR反應。反應體系25μL，反應條件95℃ 120秒，95℃ 15秒，60℃ 20秒45個循環，72℃20秒中止。

2.3 實時熒光定量RT-PCR數據分析 實驗結果利用軟件Rotor-Gene 6.0以及Excel 7.0進行數據分析處理。

2.4 實時熒光定量RT-PCR結果

2.4.1 Gna12的擴增曲線 見圖10。

2.4.2 Gna12的標準曲線 見圖11。

2.4.3 Gna12的擴溶解曲線 見圖12。

2.4.4 Gna12的Copies值 Gna12實時定量結果表明，模型組大鼠腎臟組織Gna12表達下調，而經腎消康治療后大鼠腎臟組織中Gna12表達上調，見圖13。

3 討論

細胞間通過傳遞信號分子相互交流，G蛋白系統是細胞中最常見的信號傳遞方式。G蛋白即鳥嘌呤核苷酸（GTP）結合蛋白，具有GTP酶活性，是在細胞信號通路中起信號轉換器或分子開關作用的蛋白質，是細胞信號傳導通路上的重要組成部分，體內外許多激素、遞質、毒物和藥物等均可通過G蛋白引起細胞內相應的第二信使改變，導致一系列生理生化變化[1]。

G蛋白可分為兩類：1）由α、β和γ亞單位組成的異三聚體，在膜受體與效應器之間的信號轉導中起中介作用；2）小分子G蛋白，為分子質量21～28 ku的小肽，只具有G蛋白α亞基的功能，在細胞內進行信號轉導，屬于小GTP酶的Ras超家族。

當受體被配體激活后，Gα上的GDP為GTP所取代，這是G蛋白激活的關鍵步驟。此時G蛋白解離成GTP-Gα和Gβγ兩部分，它們可分別與效應器作用，直接改變其功能，如離子通道的開閉，或通過產生第二信使影響細胞的反應。Gα上的GTP酶水解GTP，終止G蛋白介導的信號轉導。此時，Gα與Gβγ又結合成無活性的三聚體[2]。

目前，Gα亞基主要有Gαs、Gαi、Gαq/11 和Gα12/13幾種不同的類型。它們主要是在效應識別上不同，但卻有著相似的激活機制。Gαi抑制ATP生成cAMP；Gαq/11刺激膜結合的磷脂酶C測試，然后將PIP2裂解成兩個第二信使：IP3和二酰基甘油（DAG）；Gα12/13參與Rho家族GTP酶信號轉導（通過RhoGEF家族）和控制細胞骨架重構，從而調節細胞的遷移[3]。

細胞骨架是一動態纖維網絡，具有細胞收縮、維持細胞形狀、細胞運動、黏附、吞噬等功能[4]。細胞骨架的主要成分是微絲，肌動蛋白（actin）是微絲的基礎蛋白，以纖維狀肌動蛋白（F-actin）和單球狀肌動蛋白（G-actin）兩種形式存在并相互轉換，調節系膜細胞的收縮狀態，從而調節毛細血管口徑及腎小球濾過率[5]。

G蛋白是細胞中重要的信號轉導分子，是許多信號傳遞途徑的中心環節，因此也就成了眾多藥物和毒素攻擊的靶位點。事實上，如糖尿病、失明、過敏、抑郁癥、心血管缺陷和某些癌癥疾病以及其他病癥，都被認為是由于G蛋白信號紊亂引起的[6]。但Gna12在DN發病機制中的作用目前還不得而知，國內外相關研究極少，從本實驗研究結果可以看出：在DN狀態下，模型組大鼠腎臟Gna12表達下調，筆者由此推斷高糖影響了Gna12的信號轉導功能，從而使F-actin解聚，細胞骨架重構導致系膜細胞收縮功能失調，造成早期DN腎小球的高濾過狀態，導致DN的發生。

DN為本虛標實之證，病及五臟六腑、氣血經絡，其臟腑虛損以脾腎為著，脾虛則其運化、升清、散精的作用不足，血中精微不能輸布臟腑，濡養四肢，積蓄過多則隨小便漏泄體外，發為消渴[7]。脾腎兩虛是病理基礎，濕濁瘀血既是病理產物又是致病因素，脾腎虧虛、濕濁瘀血貫穿DN始終。

腎消康具有補腎健脾、利濕泄濁、化瘀通絡的作用。腎陰得充則一身陰液得養，腎陽不虛，其蒸騰氣化功能正常，腎之封藏功能如常，精微物質存內為機體所用而不外泄。健脾益氣，培補后天之本，使水谷精微得以四布，臟腑得養，清者得升，濁者得降，濕濁得化，精微得布；脾氣充盛又可化生氣血，血流通暢，祛除瘀血形成之源。利濕泄濁可通過促進代謝，使體內精微物質得到利用，使本身有害物質得到清除。活血化瘀可使經絡之瘀滯得除，各臟腑得新血濡養。

腎消康，其藥物組成有生地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、人參、黃芪、枸杞子、陳皮、葛根、水蛭等。方中以六味地黃湯為基礎方，滋陰清熱。枸杞子藥性平和，為平補陰陽之佳品，用之增強補腎之力；人參、黃芪補虛扶正，且人參、黃芪與茯苓、澤瀉、葛根、水蛭配伍，使扶正與祛邪協調兼顧，祛邪不傷正、扶正不留邪；陳皮與葛根配伍，陳皮辛散苦降，長于理氣燥濕健脾瀉胃濁，調中快膈；葛根升津、升發清陽、鼓舞脾胃清陽之氣；水蛭破血逐瘀，效強而不傷正。方中諸藥相合，祛邪而不傷正，扶正而不留邪，標本兼顧，為臨床治療DN的良方[8]。王盛發等[9]通過糖尿病腎病中醫治療用藥規律分析，總結了一些用藥頻度較高的中藥，如黃芪、茯苓、山藥、山茱萸等，中藥類型則以補益、健脾、活血、清熱類為多，這為本方用藥提供了有力的參考依據。

現代藥理證實：生地、山茱萸、山藥、黃芪、茯苓、澤瀉均有降血糖作用；黃芪有雙向調節血糖作用和減少尿蛋白排泄作用；茯苓、澤瀉降糖降脂改善糖脂代謝，增加腎血流量，促進腎功能恢復[10]。譚俊珍等[11]認為六味地黃丸對糖尿病大鼠糖、脂代謝有一定的改善作用。

4 結論

本研究應用Affymetrix Rat2302.0基因芯片檢測糖尿病大鼠腎臟基因表達譜，篩選差異表達基因，Gna12基因是篩選出的腎臟差異表達基因和藥效靶點之一，并對該基因做熒光定量RT-PCR測序分析。基因功能分析表明，在DN狀態下，模型組大鼠腎臟Gna12表達下調，表明Gna12的信號轉導功能受到影響。腎消康中劑量組Gna12表達上調，中藥復方腎消康可調控Gna12的信號轉導功能，對Gna12有良性調節作用。其作用機制有待于更深入研究。

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