高效液相色譜法同時測定青蒿綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯含量*

孫玉剛 ，秦續文 ，張 玲 ，李 晉 ，蕭 偉 ，王振中 ，成志東 ，常艷旭 ，，3

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津 300193；2.江蘇康緣藥業股份有限公司博士后工作站，連云港 222001；3.天津中醫藥大學中醫藥研究院，中藥化學與分析重點實驗室，天津 300193）

青蒿為菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥全草,具有清熱解毒[1]、抗瘧等功效[2]。青蒿藥用歷史悠久,在全國各地均有分布。研究表明青蒿素及其衍生物是青蒿抗瘧的主要有效成分，并被研制成抗瘧新藥,是世界衛生組織（WHO）推薦的治療瘧疾的首選藥物。同時，青蒿作為常用中草藥，是臨床有效中藥熱毒寧注射液的重要組成部分，在熱毒寧注射液臨床療效起著重要的作用。

青蒿的化學成分種類較多,主要有黃酮類、香豆素、萜類、苯丙酸類和揮發油[3]。綠原酸、隱綠原酸作為熱毒寧注射液有效成分[4]，在青蒿有分布[5]。香豆素成分可能是青蒿解熱降溫療效的有效部位[6]，主要有東莨菪內酯、香豆素等。目前,青蒿中青蒿素、黃酮類和香豆素類成分均有含量測定的報道[7-9]，但是綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯同時測定方法未見報道。本實驗首次建立了高效液相色譜法（HPLC）同時測定青蒿中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯含量的方法，并對人工種植青蒿中以上3種成分含量進行測定，擬為青蒿藥材的規范化種植及質量評價提供研究手段。

1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2487雙波長檢測器，Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。甲醇和乙腈為色譜純（天津康科德科技有限公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯等標準品購自成都曼斯特生物技術有限公司，經色譜法檢測純度在98%以上。6批青蒿樣品采自江蘇康緣藥業股份有限公司東海縣青蒿基地（2010年10月），自然曬干，含量測定前60℃下烘干12 h，粉碎后過100目篩，得粉末。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:A 乙腈，B 0.1%甲酸水；梯度洗脫程序：0～6 min，9%～10%A；6～12 min，10%～11%A；12～25 min，11%～12%A；25～30 min，12%～13%A；30～35 min，13%～13%A；9%A 平衡5 min流速：1.0 mL/min；檢測波長：325 nm；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。

2.2 對照品溶液的制備 取綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯對照品適量，精密稱定，加60%甲醇溶解并稀釋，制成濃度分別為30.9、31.2、30.3 μg/mL混合對照品液。

2.3 供試品溶液的制備 取青蒿粉末0.30 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入60%甲醇定容至刻度，稱質量，超聲60 min，放冷，稱定質量，用60%甲醇補足失質量，搖勻，14000 r/min離心10 min，取上清液，作為供試品溶液。

3 結果

3.1 色譜條件的優化 色譜條件考察時，選擇乙腈-水作為流動相,結果發現樣品的色譜峰分離度較差并且有一定拖尾現象。經多次實驗后，最終確定以乙腈-0.1%甲酸溶液作為含量測定的流動相,采用梯度洗脫，所得色譜峰峰形尖銳,分離度高，見圖1。

3.2 樣品提取條件的優化 本研究采用了單因素分析方法，考察了超聲波法制備供試品溶液條件,比較了不同提取時間（20、30、40、50、60、80 min）、不同提取溶液甲醇濃度（40%、60%、80%、100%）對綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯提取的影響,研究結果表明，3種有效成分隨著超聲時間的延長提取率變高，但在60 min時3種有效成分含量較高；而隨著甲醇濃度的升高，有效成分的提取率呈先上升后下降的趨勢，60%甲醇提取效果最好，因此，最后確定以60%甲醇超聲提取60 min為最佳提取條件。

3.3 方法學考察

3.3.1 線性范圍、標準曲線、定量限、檢測限 精密稱取綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯對照品適量,配制一系列不同濃度的對照品溶液,分別進樣10 μL，按上述色譜條件測定其峰面積各個化合物的峰面積。以化合物進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯標準曲線分別為Y贊=19 327X+u="1（r=0.9999）、Y贊=10 063X-339.2（r＝0..2（＝）、Y贊=17 606X-7606（r＝0.9999），線性范圍分別為 0.515～30.900、0.520～31.200、0.501～30.300 μg/mL，檢測限分別為 0.103、0.104、0.202 μg/mL，定量限分別為 0.31、0.32、0.60 μg/mL。

3.3.2 精密度實驗 取同一供試品溶液，連續進樣6次，測定其濃度，計算它們的相對標準偏差。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯RSD分別為0.8%、1.7%和1.5%，表明該系統進樣精密度良好。

3.3.3 重復性實驗 取同一批樣品,制備供試品溶液6份，測定其濃度,計算它們的相對標準偏差。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯RSD分別為2.8%、2.9%和2.8%，表明方法重復性好。

3.3.4 穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進樣，測定其濃度，計算其相對標準偏差。綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯RSD分別為2.7%、2.8%和2.8%，表明樣品溶液在24h內穩定。

3.3.5 加樣回收率 取已知含量的青蒿樣品粉末6份，每份約0.15 g，精密稱定，分別加入適量綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯對照品，供試品溶液制備方法制備，并依法測定。計算回收率，結果表明綠原酸的平均回收率為100%，RSD為1.9%，隱綠原酸的平均回收率為102%，RSD為2.5%，東莨菪內酯的平均回收率為99.7%，RSD為2.7%，說明綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯的提取和檢測方法可行。

以上青蒿有效成分定量方法學考察結果表明，該方法精密度、重復性、回收率結果均較好，能夠準確、快速地測定青蒿藥材中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯3種成分的含量。

3.4 樣品測定 分別吸取對照品溶液和6批人工種植青蒿的供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測定,并計算綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯的含量。結果見表1，可知人工種植青蒿綠原酸含量在（0.532±0.185）mg/g，隱綠原酸含量在（0.119±0.016）mg/g，東莨菪內酯在（0.78±0.09）mg/g，人工種植青蒿有效成分相對比較穩定。

4 討論

本實驗建立了高效液相色譜法同時測定青蒿中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯含量的方法，并對其進行了方法學考察。結果顯示該方法準確度高，專屬性強、靈敏度及穩定性均較好，測定結果能客觀準確地反映青蒿藥材中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯的含量。

表1 人工種植青蒿綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯含量測定結果Tab.1 Result of chlorogenic acid,cryptochlorogenic acid and scopoletin content of cultivated A.Annua L mg/g

測定結果表明，人工種植青蒿中東莨菪內酯含量最高，綠原酸次之，隱綠原酸最低。青蒿中綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯是熱毒寧注射液中重要的藥效成分，對其含量測定方法的研究，有利于從原材料對熱毒寧注射液進行質量控制。

本實驗對人工種植青蒿中的綠原酸、隱綠原酸和東莨菪內酯3種有效成分進行了測定,今后還將對種植密度和環境條件對青蒿中3種有效成分含量的影響和不同生育期變化規律做進一步研究,為青蒿規范化種植提供科學依據。

[1]王 建，李 錦，孫 瑜，等.GC-MS鑒別清熱抗感顆粒中青蒿、荊芥穗和薄荷[J].天津中醫藥大學學報，2007，26（4）：210-212.

[2]肖培根.新編中藥志（第三卷）[M].北京：化學工業出版社，2001：154.

[3]張秋紅，朱子微，李 晉，等.中藥青蒿化學成分與種植研究現狀[J].中國醫藥導報，2011,8（19）：10-12.

[4]畢宇安，王振中，宋愛華，等.熱毒寧注射液高效液相色譜指紋圖譜研究及多成分定量分析[J].世界科學技術·中醫藥現代化，2010，12（2）：298－303.

[5]宮毓靜，閆 寒，李愛媛，等.青蒿總香豆素解熱作用及其機理初步研究[J].中國實驗方劑學雜志，2008，14（12）：49－52.

[6]夏錚錚，李 勁，張小松.黃花蒿中青蒿素含量測定方法的研究進展[J].西部藥學，2006，3（1）：40－41.

[7]李 敏，王佳黎，吳蜀瑤.高效液相色譜法測定青蒿不同部位山柰素含量[J].時珍國醫國藥，2008，19（10）：2425－2426.

[8]薛洪寶，焦艷娜，龐國偉，等.青蒿中6種成分同時定量的高效液相色譜法研究[J].四川大學學報（工程科學版），2009，41（4）：119－124.

[9]吳蜀瑤，李 敏，王佳黎.HPLC測定青蒿植株不同部位的東莨菪內酯含量[J].中國現代中藥，2010，12（6）：20－22.