清肺化痰膠囊對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道上皮水通道蛋白-5表達的實驗研究

2012-11-29 00:48:58尹新中劉桂穎朱振剛狄冠麟

天津中醫藥 2012年5期

尹新中，劉桂穎，朱振剛，狄冠麟，陳磊

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科，天津 300193；2.天津中醫藥大學附屬保康醫院，天津 300193）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種具有氣流受限特征的可以預防和治療的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展[1]。其患病人數多，病死率高[2]。

痰液是影響COPD病情和預后的危險因素，同時也是其病理產物，更是治療COPD的關鍵。本實驗通過清肺化痰膠囊對COPD大鼠氣道上皮細胞水通道蛋白-5（AQP-5）表達和肺組織勻漿中的中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）水平的影響進而探討中藥治療COPD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物雄性Wistar成年大鼠，鼠齡200 d，體質量（200±20）g，由天津中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 AQP-5免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、NE酶聯免疫吸附實驗（ELISA）A試劑盒（北京尚柏生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模大鼠實驗環境馴養1周后，36只大鼠按隨機數字表法分為6組（模型組、空白組、清肺化痰組、氨溴索組、痰熱清組、紅霉素組），每組6只。參照文獻宋一平[3]、李澤庚[4]的方法制備COPD大鼠模型：6個實驗的大鼠除空白組外均參照文獻進行造模，即第1天和第14天氣管內注入脂多糖（LPS）200 μg/200 μL，第 2～13 天、第 15～28天在72 L密閉箱內熏5%大前門牌香煙，0.5 h，每日上午。

1.2.2 藥物制備及給藥方法實驗用藥由天津中醫學院第一附屬醫院藥房統一購進。大鼠的用藥劑量按體表面積[5]比值進行換算，持續給藥14 d。模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃；空白組不給藥；清肺化痰組給予清肺化痰膠囊溶液灌胃，按劑量0.56 g/（kg·d）給藥（清肺化痰膠囊配制成0.14 g/mL混懸液）；氨溴索組給予鹽酸氨溴索注射液腹腔注射，2.7 mg/（kg·d）；痰熱清組給予痰熱清注射液腹腔注射，1.8 mL/（kg·d）；紅霉素組給予乳糖酸紅霉素腹腔注射，0.09 g/（kg·d）。

1.2.3 標本制備實驗第29天將大鼠頸椎脫臼處死。自劍突下由皮膚至皮下向上剪開胸腔，迅速暴露肺部，取左肺上葉和主支氣管，生理鹽水漂洗干凈，吸水紙拭干，置于10%中性甲醛溶液中固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明標本，浸蠟，包埋，切片。0.2 g右肺中葉組織勻漿分別離心后留取上清液待檢測。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 AQP-5的檢測參照陳國兵[6]、王可[7]、劉少濱[8]的方法，5 μm切片脫蠟至水,3%的過氧化氫（H2O2）滅活內源性過氧化物酶5～10 min，熱修復抗原，10%正常血清封閉 20 min，一抗（1∶1600）為兔抗大鼠AQP-5多克隆抗體，4℃過夜，加生物素化山羊抗兔 IgG（二抗），37℃，20 min，滴加鏈霉素和素復合體（SABC），37℃，20 min，各步后均在磷酸鹽緩沖液（PBS）中漂洗數次。二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，電子顯微鏡觀察，照相。陰性對照組滴加PBS代替AQP-5一抗，處理同前。染色結果判定：肺組織出現明確的棕黃或棕褐色顆粒為陽性。每組于400倍高倍鏡下隨機選取30個視域，用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統進行定量分析。以0.207 μm 象素點長，在 1.8256×104μm2測量窗下，測量棕黃色反應物信號的總面積（一個視域中陽性信號的總面積）、面積百分比（總面積與參考面積之比，也稱面密度）、積分光密度（各個單獨探測象素密度分布的總和，反應陽性信號的強度），分析各組大鼠肺細支氣管上皮對AQP-5表達的相對水平。

1.2.4.2 NE的檢測按照中性粒細胞彈性蛋白酶ELISA說明書，測定肺組織勻漿上清的NE。操作步驟簡述如下：1）加樣。2）棄去液體，甩干，不用洗滌。3）溫育，棄液，甩干，洗板。4）加檢測溶液B工作液，溫育。5）棄液，甩干，洗板。6）加底物溶液，顯色。7）加終止液。8）用酶聯儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。

1.3 統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件進行。實驗數據均用均數±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理改變光鏡下（×100、×400）觀察：模型組大鼠支氣管上皮變性、壞死，纖毛缺失；管壁增厚，部分區域黏膜層上皮細胞脫落、不完整。肺泡壁可見塌陷、肺泡腔擴大及大泡形成；間質及大氣管黏膜下可見大量淋巴細胞、中性粒細胞及組織細胞浸潤，小動脈壁明顯增厚?？瞻捉M未見上述改變。其余各治療組大鼠肺組織病理改變均輕于模型組，鏡下可見支氣管上皮輕度變性、脫落，部分纖毛缺失；管壁輕度增厚。肺泡壁未見明顯塌陷，偶見肺泡腔輕度擴大，未見大泡形成；間質可見少量淋巴細胞浸潤。小動脈壁輕度增厚。見圖1、圖2。

2.2 各組大鼠肺細支氣管上皮細胞AQP-5免疫組化染色結果肺細支氣管上皮細胞AQP-5蛋白面積百分比、積分光密度模型組明顯低于清肺化痰組、沐舒坦組、紅霉素組、痰熱清組和空白組（P＜0.05）；清肺化痰組與空白組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；清肺化痰組高于沐舒坦組、紅霉素組、痰熱清組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 6組大鼠肺組織HE染色（×100）Fig.1 Lung tissue HE staining of six groups（×100）

圖2 6組大鼠肺細支氣管上皮細胞AQP-5免疫組化染色(×400)Fig.2 The immunohistochemical staining of AQP-5 bronchial epithelial cells(×400)

表1 各組大鼠肺細支氣管上皮細胞AQP-5表達（±s）Tab.1 Expression of AQP-5 in the bronchiolar epithelial cells of lung in rat（±s）

組別 n模型組 6空白組 6清肺化痰組 6痰熱清組 6紅霉素組 6沐舒坦組 6面積百分比（%）積分光密度(IOD值)1.353±0.5060112.958±44.1786.480±3.0001063.440±553.9425.230±1.6960599.235±166.3783.835±2.1210375.775±200.2041.679±1.0050201.229±128.0672.574±1.0940233.918±97.064

2.3 肺組織勻漿的NE含量檢測結果模型組明顯高于清肺化痰組、沐舒坦組、紅霉素組、痰熱清組和空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而清肺化痰組與空白組、痰熱清組、紅霉素組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），清肺化痰膠囊組明顯低于沐舒坦組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織勻漿NE水平（±s）Tab.2 The quantity of NE in the lung homogenate（±s）mg/mL

組別 n NE水平模型組 61.672±0.273空白組 60.445±0.104清肺化痰組 60.605±0.110痰熱清組 60.482±0.134紅霉素組 60.720±0.204沐舒坦組 61.048±0.138

3 討論

清肺化痰膠囊是本院呼吸科的協定處方，臨床用于治療COPD急性期患者頗有成效[9-10]。其依據COPD急性期以標實為主，多見“痰、熱、瘀”，以清肺化痰，活血化瘀為主要治法而擬成。方中炙麻黃、生石膏一辛溫，一辛寒，一宣肺，一清肺，且能透邪于外，合用則相反之中寓相輔之意，宣肺平喘而不助熱，清解肺熱而不涼遏。杏仁降利肺氣而平喘咳，與麻黃相配則宣降相因，與石膏相伍則清肅協同。吳繼全[11]認為肺系病常影響腸胃功能，肺氣不降易致胃氣不降，而有脹滿、大便不暢等表現，常選具有肺胃同治藥物,如杏仁。黃芩、瓜蔞清肺化痰，半夏、厚樸降氣化痰止咳，桃仁祛瘀通絡平喘，炙甘草調和諸藥。諸藥相伍，共奏清肺化痰、活血祛瘀之功效。

黏液的黏稠度由黏蛋白和水分的多少決定，AQP-5是一參與水分轉運的跨膜蛋白，其表達與功能異常將引起水鹽代謝失衡而影響氣道黏液的黏稠度[12]。AQP不僅與水轉運有關，還可能參與氣道黏液分泌調節以及氣道反應性的調節，因而AQP可能與氣道阻塞性疾病如COPD、肺囊性纖維化、哮喘等有關[13]。從目前的研究來看，已發現10余種AQP，其中AQP-5決定著氣道表面液體層的含水量，進而影響氣道表面液體層的理化性質，影響著黏液纖毛清除系統的功能，從而影響黏液分泌狀態，因此，與呼吸道黏液高分泌相關的水通道蛋白多選用AQP-5[14]。陳智鴻等通過實驗研究表明AQP-5基因缺失可能使小鼠氣道過敏原的應激性提高，從而促進黏液高分泌[15]。王可等[7]的研究表明，COPD患者的黏膜下腺AQP-5較對照組表達降低，氣道上皮分泌的哮喘氣道黏蛋白（MUC5AC）以及黏膜下腺分泌的黏蛋白較對照組均增加，且AQP-5的表達與MUC5AC和黏蛋白的分泌具有負相關關系，提示AQP-5可能參與了COPD患者氣道黏液分泌。

NE可使腺體分泌增多，纖毛上皮細胞受損，還能誘導白細胞介素-8（IL-8）的分泌，或分解激肽釋放酶原使激肽釋放酶具有活性，放大炎癥反應。另外，NE可增強病原菌與上皮細胞間的黏附力，使感染容易發生，還可降低補體或抗體的調理作用，降低病原菌的清除率，并且是目前已知的促黏蛋白生成和分泌的最強刺激因子，并呈時間依賴性增加氣道黏蛋白的表達[16]。NE能夠消化、降解細胞外基質和上皮連接結構造成氣道上皮完整性破壞和肺組織損傷，并通過促進炎性細胞聚集，引起黏液高分泌等機制促使慢性阻塞性肺疾病氣道炎癥與重構的發生[17]。

本實驗結果表明，清肺化痰膠囊治療COPD，其機制在于能調節AQP-5的表達，調節黏蛋白分泌，抗炎癥反應，抑制NE的表達，調節蛋白酶-抗蛋白酶失衡，從而改善黏液高分泌狀態，起到緩解COPD臨床癥狀、促進排痰、提高生活質量的目的。本實驗設計中還存在不足，比如所用大鼠數量少，兩組實驗數據的相關性分析未完成。最后，因中藥的多靶點效應，清肺化痰膠囊調節大鼠氣道上皮APQ-5表達的作用途徑尚不明確，有待更進一步探索研究。

[1]中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）[J].中華結核和呼吸雜志，2007，30（1）：8－17.

[2]林旋齡，鐘亮環，劉小虹.治喘之法，不只在于肺腎亦在于脾[J].天津中醫藥大學學報,2010,29(4):177-178.

[3]宋一平.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預的影響[J].中華內科雜志，2000，39（8）：556－557.

[4]李澤庚，王傳博，彭波，等.慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證大鼠模型的建立[J].天津中醫藥，2010，27（1）：43－45.

[5]徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛生出版社，2006：195－201.

[6]陳國兵，許峰，盧仲毅，等.不同發育階段大鼠肺水通道蛋白表達的變化[J].中國當代兒科雜志，2008，10（4）：523－526.

[7]王可，馮玉麟，文富強，等.慢性阻塞性肺疾病患者氣道上皮水通道5的表達與黏液高分泌[J].中國呼吸與危重監護雜志，2006，5（5）：357－360.

[8]劉少濱，歐陽金生，黃紹光，等.氨溴索對脂多糖-煙霧誘導大鼠水通道蛋白5的影響[J].上海交通大學學報（醫學版），2008，28（3）：307-310.

[9]劉蘭萍，尹新中，劉貴穎，等.清肺化痰膠囊治療COPD急性發作期臨床觀察 [J].遼寧中醫雜志，2008，35（12）：1867－1868.

[10]尹新中，劉貴穎，張慧琪，等.中西醫結合治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期 30 例臨床分析[J].天津中醫藥，2005，22（2）：117－118.

[11]吳繼全，王雪京，張洪春，等.晁恩祥教授治療肺系病的特色經驗[J].天津中醫藥，2008，25（5）：358－359.

[12]周正，劉劍波.糖皮質激素對哮喘小鼠肺組織水通道蛋白5表達的影響[J].江蘇醫藥，2010，36（8）：924－926.