疏肝健脾方對腹瀉型腸易激綜合征大鼠血漿及結腸組織5-HT、SP、VIP的影響*

汪正芳，郭前坤，張聲生

（首都醫科大學附屬北京中醫醫院消化中心，北京 100010）

腸易激綜合征（IBS）是腸道動力學和內臟感覺異常的胃腸道功能性疾病，是一組以排便習慣改變（腹瀉、便秘）、糞便性狀異常（稀便、黏液便）、腹脹及腹痛等為臨床表現的綜合征，癥狀可持續存在或間歇發作[1]。臨床上以腹瀉型為多見[2-3]。IBS病因及發病機制至今尚未完全闡明，目前治療缺乏確切而有效的辦法。中醫學認為腹瀉型腸易激綜合征與肝郁、脾虛密切相關[4]。筆者采用具有調肝理脾、燥濕止瀉作用的疏肝健脾方治療腹瀉型腸易激綜合征（D-IBS）在臨床已經取得了很好的療效。本實驗以血漿中的 5-羥色胺（5-HT）、P物質（SP）及血管活性腸肽（VIP）和結腸組織中SP及VIP為主要測定指標，以得舒特為陽性對照藥，觀察疏肝健脾方對D-IBS模型大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質量（200±20）g，北京維通利華實驗動物公司提供，合格證號：SCXK（京）2006-0009。

1.2 藥品與試劑 冰醋酸，國藥集團化學試劑有限公司（批號：20110517）。得舒特（匹維溴安），法國蘇威制藥（批號：621959）。5-HT、SP及VIP試劑盒由北京華英生物技術有限公司提供。

疏肝健脾方：由黨參、白術、八月札、白芍、陳皮等藥物組成，均由首都醫科大學附屬北京中醫醫院制劑中心制備，按一定比例制成生藥濃度分別為1.7、3.4、6.8 g/mL 備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 大鼠適應性喂養3 d后按隨機數字表法隨機分組為正常組、模型組、得舒特組，以及中藥低、中、高劑量組，每組10只。正常組：正常喂食，自由飲水，不予任何處理；模型組，得舒特組及中藥低、中、高劑量組以乙酸灌腸加束縛應激的方法建立D-IBS大鼠模型。

1.3.2 造模方法 實驗前18 h禁食、不禁水，乙醚麻醉后經肛門插入連接注射器的硅膠管（距肛門8 cm），結腸內灌入40 mL/L的乙酸1 mL，緩慢拔出硅膠管，用手壓迫肛門并將大鼠尾巴抬高30秒，后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）1 mL沖洗結腸[5]，放回籠中自由活動進食水，于第7天行束縛應激，每天用寬透明膠帶束縛前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部[6]，束縛時間2 h，連續束縛7 d。

1.3.3 動物給藥方法 各組造模結束后第2天開始進行藥物干預。得舒特組按照實驗動物研究“等效劑量”的計算方法，給予15 mg/（kg·d）灌胃給藥；中藥低、中、高劑量組（按60 kg成人體表面積換算，低、中、高劑量組分別為標準劑量組、2倍劑量組及4倍劑量組）分別給予17、34、68 g/（kg·d）；正常組和模型組每天灌服等容量生理鹽水，連續治療14 d。給藥體積10 mL/（kg·d）。

1.4 檢測指標及方法 觀察大鼠的一般情況，檢測大鼠糞便的含水量及腹壁撤退反射（AWR）評分，血漿及結腸組織中5-HT、SP及VIP含量。

1.4.1 糞便含水量 在大鼠造模完成后及治療結束后分別稱量各組大鼠糞便的濕質量及干質量，糞便含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%。

1.4.2 AWR評分 大鼠實驗前18 h禁食不禁水，在乙醚麻醉下，將涂石蠟油帶氣囊的8F導尿管經肛門插入（氣囊末端距肛門1 cm，在肛門外1 cm處將其固定在大鼠尾根部），將大鼠放入特制的透明塑料桶籠內（20 cm×8 cm×8 cm）中，只能前后運動不能轉身，待大鼠適應環境30 min后開始實驗。每只大鼠給予球囊擴張4次，容量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mL，每次擴張持續5 min，間隔30秒（防止出現腸道缺血壞死）。

AWR評分標準[7]：0分，結直腸擴張刺激時大鼠情緒基本穩定；1分，給予刺激時開始出現不穩定，偶有扭動頭部；2分，刺激時腹背部肌肉輕微收縮但腹部不抬離地面；3分，給予刺激時腹背部肌肉較強烈收縮并有腹部抬離地面情況；4分，刺激時腹部肌肉強烈收縮，腹部呈弓形，腹部﹑會陰部抬離地面。

1.4.3 血漿及結腸組織標本采集

1.4.3.1 血漿標本制備 以10%水合氯醛（3 mL/kg腹腔注射），麻醉下，腹主靜脈取血3 mL，注入含有10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）30 μL 和抑肽酶1000 KIU試管中混勻，低溫離心15 min，轉速2000 r/min，分離血漿，分裝置于-20℃冰箱保存待測。測定前將樣本置于自來水浴中復融，再次低溫離心（1500r/min，15min），取上清進行放射免疫實驗。

1.4.3.2 結腸組織標本制備 禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，剖開腹腔，取出結腸并剪下（距離肛門8 cm以內），沿著腸系膜縱向剪開，用冰生理鹽水反復沖洗，濾紙拭干，-80℃冰箱凍存。測前取出組織稱質量后于生理鹽水（1 mL）中煮沸3 min，冷卻后加入1mol/L冰醋酸0.5mL于勻漿器中勻漿，再用1 mol/L NaOH中和，低溫離心20 min，3000 r/min。取上清液儲存于-20℃以下待測。

1.5 統計方法 用SPSS18.0統計軟件分析，所有實驗計量數據均以均數±標準差（±s），正態分布計量資料組間比較采用單因素方差分析，偏態分布計量資料組間比較采用軼和檢驗，以P<0.05為差異且有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠存活情況及一般情況觀察 在實驗過程中，共死亡5只大鼠，其中中藥高劑量組2只，中劑量組1只，得舒特組2只，其余各組大鼠情況良好。筆者在使用乙酸灌腸加束縛應激造模過程中發現大鼠性情明顯改變，急躁易怒，觸碰不得；毛發晦暗無光澤，食欲下降，排稀便明顯，與D-IBS的臨床表現相近。上訴表現經藥物干預后各治療組均較模型組有明顯好轉。

2.2 疏肝健脾方對大鼠糞便含水量的影響 疏肝健脾方能明顯改善D-IBS大鼠糞便的含水量，促進腸道對水分的重吸收增加，與模型組比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。高劑量疏肝健脾方要優于匹維溴銨（P＜0.05）。見表1。

表1 治療前后糞便含水量的比較（±s）Tab.1 Comparison of defecation moisture before and after treatmen（±s）%

表1 治療前后糞便含水量的比較（±s）Tab.1 Comparison of defecation moisture before and after treatmen（±s）%

注：與模型組比較，*P<0.01，與得舒特組比較，#P<0.05。

組別 給藥后正常組 20.45±1.65*模型組 45.20±1.28得舒特組 25.41±2.08*疏肝健脾低劑量組 30.33±3.41*疏肝健脾中劑量組 25.26±2.22*疏肝健脾高劑量組 20.17±2.86*#n 101081098給藥前20.35±2.50*45.89±2.3745.07±2.4445.50±2.4644.90±2.6244.93±2.41

2.3 AWR的影響 在不同的擴張容量下，模型組大鼠AWR評分較其余各組明顯增加，說明模型組大鼠內臟敏感性增加，中藥低劑量組雖也有改善，但在不同擴張容量下不一致，說明疏肝健脾方劑量太少時也達不到很好的改善內臟敏感性的作用。見表2。

表2 給藥后AWR比較（±s）Tab.2 Comparison of AWR after treatmen（±s）分

表2 給藥后AWR比較（±s）Tab.2 Comparison of AWR after treatmen（±s）分

注：與模型組比較，*P<0.01，#P<0.05。

組別 1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL正常組 0.90±0.42*1.97±0.19*2.67±0.31*模型組 1.50±0.362.63±0.253.73±0.26得舒特組 0.97±0.25*2.03±0.19*2.73±0.31*疏肝健脾低劑量組 1.30±0.292.43±0.16#3.60±0.21疏肝健脾中劑量組 1.03±0.29*2.10±0.16*2.77±0.32*疏肝健脾高劑量組 0.93±0.21*2.07±0.14*2.63±0.29*n 1010810980.5 mL 0.07±0.14*1.13±0.230.17±0.24*0.57±0.23*0.37±0.25*0.20±0.23*

2.4 疏肝健脾方對D-IBS大鼠血漿5-HT的影響疏肝健脾方中、高劑量組血漿5-HT含量明顯低于D-IBS大鼠（P<0.05），疏肝健脾方低劑量組雖然與模型組也有區別，但是差異沒有統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組血漿中5-HT含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in blood plasma of each group（±s）μg/L

表3 各組血漿中5-HT含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in blood plasma of each group（±s）μg/L

注：與模型組比較，*P<0.01，#P<0.05。

組別 n 血漿5-HT含量正常組 10148.280±35.283#模型組 10195.545±25.383得舒特組 8151.594±39.852#疏肝健脾低劑量組 10188.850±17.628疏肝健脾中劑量組 9162.881±17.498#疏肝健脾高劑量組 8139.796±30.826*

2.5 疏肝健脾方對D-IBS大鼠血漿及結腸組織SP的影響 疏肝健脾方各劑量組血漿中SP含量較D-IBS大鼠低，但差異無統計學意義（P>0.05）；疏肝健脾方可以改善D-IBS大鼠結腸組織中SP水平（P<0.05）。見表4。

表4 各組血漿及結腸組織中SP含量的比較（±s）Tab.4 Comparison of P content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

表4 各組血漿及結腸組織中SP含量的比較（±s）Tab.4 Comparison of P content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

注：與模型組比較*P<0.01，#P<0.05。

組別 n 血漿SP含量 結腸組織SP含量正常組 1060.767±8.8247.743±1.907模型組 1066.174±6.1058.918±1.356得舒特組 860.821±5.1748.149±1.028疏肝健脾低劑量組 1052.651±9.0717.538±1.070*疏肝健脾中劑量組 963.942±7.3207.155±0.713*疏肝健脾高劑量組 864.091±3.4227.424±1.378#

2.6 疏肝健脾方對D-IBS大鼠血漿及結腸組織VIP的影響 疏肝健脾各劑量組血漿及結腸組織中VIP含量均較D-IBS模型組低，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表5。

3 討論

D-IBS臨床上主要以腹瀉、腹痛或腹部不適為主癥，其病因及發病機制復雜，其病理生理學變化主要包括胃腸道動力紊亂及內臟感覺敏感度異常等，目前認為與精神因素，胃腸激素變化，炎癥介質及免疫因素等有關[8]。腦腸肽是調節胃腸道運動的重要物質，與IBS發病密切相關，常見有5-HT、VIP、SP、神經肽-Y（NPY）等[9]。中醫學根據其臨床表現，將 D-IBS 歸屬于“泄瀉”、“腹痛”、“腸郁”等范疇，主要病機是肝郁脾虛、肝脾不和、脾虛濕盛。疏肝健脾方是多年臨床實踐和研究得出的治療D-IBS的經驗方，主要是由黨參、白術、八月札、白芍、陳皮等藥物組成。方中以黨參、白術、白芍為君藥奏調肝理脾之功；臣以八月札、陳皮等以健脾理氣燥濕；諸藥合用，調肝、理脾、燥濕、止瀉，諸功兼備，標本兼治。筆者采用乙酸灌腸加束縛應激的方法制備D-IBS動物模型以腹瀉為主要癥狀，伴有煩躁、抑郁等變化，與D-IBS臨床癥狀相似，使用該模型來探討疏肝健脾方治療D-IBS的作用機制。

表5 各組血漿及結腸組織中VIP含量的比較（±s）Tab.5 Comparison of VIP content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

表5 各組血漿及結腸組織中VIP含量的比較（±s）Tab.5 Comparison of VIP content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別 n 血漿VIP含量 結腸組織VIP含量正常組 1025.738±3.403* 4.290±0.940*模型組 1029.871±3.7785.554±1.195得舒特組 827.063±4.6024.782±0.937疏肝健脾低劑量組 1028.049±5.0274.909±0.340疏肝健脾中劑量組 927.936±3.9804.616±0.658疏肝健脾高劑量組 827.298±5.4064.555±0.809

5-HT作為一種腦腸肽，近年來被認為是參與IBS發病的胃腸激素之一，是目前研究的熱點問題。Wade[10]和Kyosola[11]研究表明IBS患者血漿5-HT含量升高；張川等[12]的研究也表明D-IBS患者血清中5-HT濃度增高；5-HT的異常升高是導致腸道動力異常和內臟感覺過敏，也是引起腹瀉的重要物質[13]。本實驗研究結果提示，本方能調節D-IBS大鼠血漿5-HT的異常變化，這可能是其改善D-IBS臨床癥狀的作用機制之一。而低劑量組雖也有降低，但差異不顯著，說明中藥對IBS的治療作用和劑量大小也有關系，呈現一定的量效關系，在劑量過小時治療效果不甚明顯。

SP是最早發現的一種神經肽，對SP與IBS的關系的研究，國內外尚無一致結論。張紅杰等[14]的研究表明腸易激綜合征的患者血漿中SP無顯著的變化。李兆申等[15]的研究表明腹瀉型腸易激綜合征患者結腸黏膜SP含量顯著高于正常對照組，并推測D-IBS腸黏膜SP含量升高可能與D-IBS患者結腸高動力，黏液分泌增多致腹瀉有關。本實驗研究結果也表明，血漿中SP的含量與腸易激綜合征之間無顯著性聯系。而大鼠結腸組織中SP含量中藥高、中劑量組明顯低于模型組，與目前的研究結果一致，提示疏肝健脾方可能是通過改變SP的異常分泌以改善胃腸道的分泌和運動功能，達到治療效果。

VIP是從豬小腸提取物中分離出的一種有明顯擴張血管降低血壓的物質，Morise K等[16]的研究發現，VIP與IBS患者的腹瀉和腹痛等癥狀相關。李兆申等[15]的研究也表明D-IBS的患者血漿中血管活性腸肽的水平較正常人明顯升高。筆者的實驗結果提示，疏肝健脾方改善D-IBS的臨床癥狀與抑制VIP的異常升高關系不是很密切。

綜上所述，本實驗以乙酸灌腸加束縛應激的方法建立的大鼠D-IBS模型在一定程度上模擬了人的D-IBS臨床表現，在使用經驗方疏肝健脾方干預后，發現疏肝健脾方可以有效緩解D-IBS大鼠腹瀉及內臟高敏性，其作用可能是通過降低5-HT及SP而實現的，但是由于中藥復方的成分不是十分肯定，起效物質也不是很明確，其具體的作用機制還有待進一步深入研究，但是調節胃腸激素很可能是疏肝健脾方發揮治療作用的一個很重要的因素。

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