正交試驗(yàn)法優(yōu)選女貞子中特女貞苷的提取工藝

張 艷，陳 健，陳海華，席 娟，謝小偉，齊君君，伍 勇，孫志良

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效，是多種中獸藥制劑的主要組分，用于提高豬與肉雞的抵抗力、生產(chǎn)性能、以及蛋雞的產(chǎn)蛋率與品質(zhì)［1－4］。女貞子含有多糖、三萜類、環(huán)烯醚萜類和對(duì)羥基苯乙醇苷類等多類化學(xué)成分，其中，特女貞苷是女貞子的主要有效成分之一［5］。在現(xiàn)行的2010年版《中國(guó)獸藥典》中，以特女貞苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)成分，但目前少有文獻(xiàn)報(bào)道女貞子中特女貞苷的提取工藝研究，本文采用正交試驗(yàn)方法，以特女貞苷的含量作為考察指標(biāo)，優(yōu)選特女貞苷的提取工藝，以期為提高獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和新獸藥開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 島津2010AHT高效液相色譜儀(SIL－20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD－20A紫外－可見(jiàn)檢測(cè)器、LCSolution工作站)(島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司);Sartorius TE 212－L電子天平，感量0.0001 g(北京賽多利斯公司);KQ－250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 特女貞苷(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)20120213，純度＞98%);女貞子藥材購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院中藥房，并按照2010版《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行鑒定，符合標(biāo)準(zhǔn);水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 特女貞苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC－C18(5 μm，4.6 mm × 150 mm);流動(dòng)相：甲醇 － 水(40 ∶60);流速 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 224 nm;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量 10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取特女貞苷適量于容量瓶中，加甲醇定容得濃度為1.0 mg/mL對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取貯備溶液0.4、0.6、1.0、1.6、2.0 mL 置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得 0.04、0.06、0.10、0.16、0.20 mg/mL 特女貞苷對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別稱取女貞子20 g，按表2試驗(yàn)方案安排實(shí)驗(yàn)，提取液濃縮后，減壓干燥得干浸膏，取女貞子提取物干浸膏適量，置于錐形瓶中，加甲醇超聲處理30 min，提取液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液即為供試液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件項(xiàng)下的步驟操作，以特女貞苷濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸線性方程為Y=6×106X+7580.9，相關(guān)系數(shù)r=0.9997，表明在 0.04 ～0.20 mg/mL 范圍內(nèi)，特女貞苷濃度與峰面積積分值成良好的線性關(guān)系。

2.1.5 樣品測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，對(duì)照品溶液、供試品溶液的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1～圖2，可見(jiàn)特女貞苷峰形較好，與其他峰分離良好。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 女貞子的主要藥效成分為水溶性，故以水為提取溶劑，采用加熱回流提取。選用提取次數(shù)(A)、加水量(B)、提取時(shí)間(C)為考察因素，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平(表1)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排(表2)，以特女貞苷的含量為考察指標(biāo)，計(jì)算公式為：特女貞苷的含量=特女貞苷提取量/女貞子投料量，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2，并進(jìn)行相應(yīng)的結(jié)果分析(表3和表4)［6－7］。從直觀分析可知，影響水提效果的因素主次順序?yàn)椋篈(提取次數(shù))＞C(提取時(shí)間) ＞B(加水量)，優(yōu)化水平是A3C3B3，但方差分析結(jié)果表明，A、B、C 3種因素中，只有A(提取次數(shù))與C(提取時(shí)間)對(duì)特女貞苷含量的影響有顯著性意義(P＜0.05)。為了降低大批量生產(chǎn)成本，最后決定提取工藝為A3B2C3，即加10倍藥材量水提取3次，每次2 h。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果(n=3)

表3 極差分析表

表4 方差分析表

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取女貞子20 g，按最佳優(yōu)化工藝A3B2C3進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得特女貞苷含量為(17.22 ±0.16)mg/g，接近正交試驗(yàn)方案中的最高值，優(yōu)化條件可行。

3 討論

選擇流動(dòng)相時(shí)，試驗(yàn)采用了以下4種方法：方法A：乙腈與0.1%磷酸，方法B：甲醇與0.1%磷酸，方法C：甲醇與水，方法D：乙腈與水。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，甲醇與水(40∶60)流動(dòng)相下樣品中特女貞苷主峰與雜質(zhì)峰分離度最佳，保留時(shí)間適中，峰形好，且對(duì)泵與色譜柱的損耗小，利于延長(zhǎng)色譜柱的壽命。同時(shí)所建立的特女貞苷HPLC測(cè)定方法，在所用色譜條件下基線穩(wěn)定，具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可適用于特女貞苷的定量。

在中藥有效成分的提取方法方面，研究者們采用溶劑提取法、半仿生提取法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法和大孔樹(shù)脂吸附法等進(jìn)行了嘗試，各有優(yōu)劣。本試驗(yàn)對(duì)女貞子中特女貞苷的研究，以特女貞苷及女貞子中大部分有效成分溶于水為出發(fā)點(diǎn)，采用水提法優(yōu)選女貞子的提取工藝，緊盯藥廠生產(chǎn)實(shí)際，便于降低成本與推廣應(yīng)用。

女貞子在畜牧獸醫(yī)上應(yīng)用廣泛，2010版《中國(guó)獸藥典》亦把特女貞苷的含量作為女貞子質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正交設(shè)計(jì)法對(duì)女貞子中特女貞苷提取條件優(yōu)化合理可行，為提高女貞子中特女貞苷提取率提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為提高由女貞子制成的制劑質(zhì)量和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新獸藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

致謝感謝湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金對(duì)本項(xiàng)目的資助以及湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心的大力支持。

［1］ 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典(二部)二〇一〇年版［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：59.

［2］ 石莉莎，單安山.女貞子調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫功能的研究進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2009，30(6)：6 －7.

［3］ 曹?chē)?guó)文，張邑凡，陳春林，等.“復(fù)方女貞子散”對(duì)繁殖母豬生產(chǎn)性能與哺乳仔豬生長(zhǎng)性能的影響［J］.飼料工業(yè)，2008，29(10)：4 －5.

［4］ 林 巍，李叔偉，楊鳳微，等.復(fù)方女貞子對(duì)雛雞抗氧化功能的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45(11)：61 －62.

［5］ 黃新蘋(píng)，王武朝.中藥女貞子的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2011，38(1)：47 －48.

［6］ 張挪威，萬(wàn)長(zhǎng)榮，趙 宏，等.四君子湯提取工藝優(yōu)化研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2011，45(6)：1 －4.

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