復方阿莫西林乳房注入劑無菌檢查方法的確立

郝利華，楊秀玉，宋 洋

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.青島農業大學，山東青島 266000)

復方阿莫西林乳房注入劑是“十一五”國家科技支撐計劃項目研制的新制劑。由阿莫西林、舒巴坦、潑尼松龍與礦物油制成的供乳房灌注用滅菌混懸油溶液，用于奶牛乳房炎的治療。阿莫西林通過抑制細菌細胞壁的合成而起抗菌作用［1］，獸醫臨床上常用于金黃色葡萄球菌、鏈球菌等革蘭陽性菌和大腸桿菌、巴氏桿菌等革蘭陰性菌引起的感染。舒巴坦是青霉烷砜類β-內酰胺酶抑制劑，與β-內酰胺類抗生素聯合應用后可產生明顯的增效作用，提高后者的抗菌活性，又擴大了抗菌譜［2-3］。處方中添加糖皮質激素類藥物潑尼松龍，以增加機體對炎癥的耐受性以及降低炎癥的血管反應與細胞反應，減少炎癥后遺癥。為了保證藥品的質量和用藥安全，必須進行無菌控制。本文根據《中國獸藥典》2010 年版一部附錄［4］、檢驗操作規程［5］對復方阿莫西林乳房注入劑的無菌檢查進行了實驗研究，建立了可靠的無菌檢查方法并進行了驗證。

1 材料與試藥

1.1 供試品 復方阿莫西林乳房注入劑(規格：12 g/支，含阿莫西林三水合物 0.8 g，批號 20090401、20090402、20090403，生產廠家：成都中牧生物藥業有限公司)。

1.2 青霉素酶 來源：中國藥品生物制品檢定所(批號20100105;規格：每1 mL大于300萬單位)。

1.3 培養基及沖洗液 培養基：硫乙醇酸鹽液體培養基、改良馬丁培養基、營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基。沖洗液：0.1%聚乙二醇或1%吐溫-80的0.1%中性酪蛋白胨滅菌溶液(酪蛋白胨1 g，加蒸餾水1000 mL，加熱溶解，調pH值為7.6，過濾，分裝滅菌)。以上培養基均由中國獸醫藥品監察所提供，培養基均經過無菌性檢查和靈敏度檢查合格。

1.4 驗證實驗用菌種(第三代) (1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)［CMCC(B)26003］;(2)銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10104］;(3)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］;(4)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64941］;(5)白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98001］(均為中國獸醫藥品監察所保存)。

1.5 儀器 杭州高得泰林HTY-2000A無菌檢查儀(杭州高得泰林生物設備有限公司)，北京牛牛基因有限公司全封閉式無菌濾器。

2 方法

2.1 菌液制備［4］(1)分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯，于35℃培養18～24 h，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數小于100 CFU的菌懸液備用。(2)取生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽培養基中，于35℃培養18～24 h，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數小于100 CFU備用。(3)取白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于25℃培養24～48 h，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數小于100 CFU備用。

2.2 菌液計數 取上述5種菌液，金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各1 mL用營養瓊脂培養基35℃培養24～48 h;白色念珠菌1 mL用改良馬丁瓊脂培養基25℃培養48～72 h，每種菌液接種2個平皿。計數，取平均值。活菌計數結果見表1。

2.3 培養基的靈敏度和無菌檢查 取裝量12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基10管，分別接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌各2管，每管接菌量為1 mL(含10～100 CFU/mL)，余下2管作為空白對照。取裝量9 mL的改良馬丁培養基4管，接種白色念珠菌2管，每管接菌量為1 mL(含10～100CFU/mL)，余下2管做空白對照，置規定的溫度培養5 d，逐日記錄培養結果。

表1 活菌計數結果表 CFU/mL

2.4 薄膜過濾法［4］取本品10支，傾倒出全部內容物，混勻，取10 g，加入300 mL含0.1%聚乙二醇或1%吐溫-80的0.1%中性酪蛋白胨滅菌溶液，振搖使充分混勻，置無菌濾器內，抽干，用上述滅菌溶液沖洗濾膜3次，每次100 mL，在最后一次的沖洗液中加入小于100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌，照薄膜過濾法［4］檢查。

2.5 直接加入法［4］

2.5.1 青霉素酶滅活劑量確定 取供試品10支，擠出內容物于無菌容器中，混勻，取供試品10 g，加稀釋液200 mL，充分振搖使分散。取上述溶液20 mL于5支滅菌試管中，分別以每1 mg阿莫西林加36000單位、18000單位、9000單位、6000單位和3000單位的青霉素酶，于37℃放置30 min，作為供試液。取上述供試液各3 mL于45 mL硫乙醇酸鹽液體培養基中，加小于100 CFU的金黃色葡萄球菌，于30～35℃培養24 h。

2.5.2 青霉素酶作用時間確定 青霉素酶滅活時間分別為20、30、45 min，其余步驟同2.5.1 項。

2.5.3 所用稀釋液的量 方法同2.5.1項，稀釋液用量分別為 300、200、100 mL。

2.5.4 培養基用量確定 按2.5.1項處理后的樣品分別加入15、45、100、300 mL硫乙醇酸鹽液體培養基中，加入規定量的金黃色葡萄球菌，按規定培養。

2.5.5 無菌驗證［4-6］取本品10支，傾倒出全部內容物，混勻，取10 g，加入200 mL含0.1%聚乙二醇或1%吐溫-80的0.1%中性酪蛋白胨滅菌溶液，充分振搖使分散均勻，加青霉素酶600萬單位(每1 mg阿莫西林加青霉素酶9000單位)，37℃孵育30 min。取8支45 mL的硫乙醇酸鹽液體培養基，分別接種小于100 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，一支加入酶作用后的供試液3 mL，另一支作為陽性對照;2支45 mL改良馬丁液體培養基，分別接種小于100 CFU的白色念珠菌，其中一支加入酶作用后的供試液3 mL，另一支為陽性對照。另取同批號的硫乙醇酸鹽液體培養基及改良馬丁液體培養基，作為陰性對照組，置規定的溫度培養3～5 d。重復無菌驗證試驗2次。

2.6 供試品無菌檢查 取三批供試品，按照驗證過的無菌檢驗方法進行檢查。

3 結果

3.1 培養基靈敏度及無菌檢查 結果如表2所示。

表2 培養基的靈敏度和無菌檢查

3.2 薄膜過濾法 采用杭州高得泰林有限公司的無菌集菌器，供試液不能全部通過濾膜;更換沖洗液，效果未改變。采用北京牛牛基因有限公司濾器過濾，能夠使藥物和沖洗液通過濾器，但過濾時間長，試驗中有崩膜現象發生。

3.3 直接加入法

3.3.1 青霉素酶滅活劑量的確定 以阿莫西林量計算，每1 mg阿莫西林加6000單位及以上青霉素酶，可將供試品滅活，結合無菌驗證最終選用每1 mg阿莫西林加9000單位青霉素酶滅活。

3.3.2 青霉素酶作用時間 青霉素酶作用20、30、45 min均可將供試品滅活，為保證作用時間，又不會使試驗時間太長，青霉素酶作用時間選用30 min。

3.3.3 所用稀釋液的量 以三個劑量的稀釋液稀釋樣品，發現供試品加入100 mL稀釋液中，油滴掛壁嚴重，影響試驗菌生長觀察，為使供試品充分分散，故選用200 mL劑量進行稀釋。

3.3.4 培養基用量 培養基用量為15 mL時，培養24 h后供試液組生孢梭菌與枯草芽孢桿菌管較對照管菌液生長緩慢，而45 mL以上時，各菌兩管生長無差別。

3.3.5 無菌驗證 結果見表3。上述驗證菌株在此實驗條件下均能生長，證明了方法的有效性。具體實驗中可選擇金黃色葡萄球菌作為陽性菌株。

3.4 供試品無菌檢查 供試品陽性對照管24 h后觀察菌液生長良好，供試品管和陰性對照管14 d內均無菌生長。

4 討論

4.1 分別按《中國獸藥典》規定的兩種無菌檢查法對復方阿莫西林乳房注入劑進行了無菌方法研究。由于乳房注入劑劑型及工藝特點，供試品較黏稠，采用薄膜過濾法時不能使濾液完全通過濾膜，操作無法進行;對不同廠家無菌集菌器進行比較，發現過濾困難并有崩膜現象發生，故無法采用薄膜過濾法。試驗最終選用直接加入法，并確定了青霉素酶的滅活劑量，建立了直接加入的無菌檢查方法，并進行了方法學驗證，本文確立的無菌檢查方法可用于該藥物的無菌檢查。

4.2 具有抑菌活性的供試品無菌檢查，可根據《中國獸藥典》二〇一〇年版一部附錄加入中和劑或滅活劑消除供試品的抑菌活性。本研究采用青霉素酶消除供試品的抑菌成分，并通過增加培養基用量消除了供試品對敏感菌的抑菌活性。

4.3 考慮到本實驗室無生物安全柜，而黑曲霉對試驗環境影響較大，且黑曲霉非本品的敏感菌，認為不做黑曲霉的無菌驗證對試驗結果無影響，故未進行黑曲霉的無菌驗證試驗。

［1］沈建忠，謝聯金.獸醫藥理學［M］.北京：中國農業大學出版社，2000.

［2］Williams J D.β -Lactamases and β -Lactamase inhibitors［J］.International journal of antimicrobial agents，1999，12(suppl 1)：S3-S7.

［3］丁宏斌，李建成，劉金鳳，等.半合成青霉素與β-內酰胺酶抑制劑對奶牛乳房炎致病菌體外聯合藥敏的研究［J］.中國獸醫雜志，2009，45(8)：87-89.

［4］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部［M］.北京：中國農業出版社，2011：附錄137.

［5］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2005：313-323.

［6］蘇德模.微生物學檢驗手冊［M］.北京：科學出版社，2000：197.