趨化因子CXCL5啟動子區-156G/C基因多態性與2型糖尿病的關系

趙艷茹 劉 波 齊曦明 尹福在

胰島素抵抗是2型糖尿病（T2DM）的核心機制，有研究證實胰島素抵抗與慢性低水平的炎癥狀態和一些細胞因子相關[1]。在T2DM發生發展中，炎癥因子可能具有重要作用[2]。CXCL5/ENA-78即上皮細胞來源的中性粒細胞活化肽，是趨化因子超家族的CXC亞族成員，參與多種炎癥反應。本研究旨在探討CXCL5基因啟動子區-156 G/C位點多態性與T2DM的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2009年2月—10月在我院內分泌科住院的T2DM患者210例為T2DM組，男女各105例，年齡（54.09±12.43）歲，體質量指數（BMI）為（25.38±3.67）kg/m2，診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標準，排除伴有急慢性感染性疾病、嚴重心腦血管病變、肝腎功能不全及嚴重T2DM急性代謝并發癥者。選取同期我院體檢中心的健康體檢者171例為對照組，男88例，女83例，年齡（52.64±11.46）歲，BMI為（25.16±3.48）kg/m2，2組間性別（χ2=0.283）、年齡（t=1.175）、BMI（t=0.601）比較差異無統計學意義（均 P>0.05）。

1.2 主要儀器試劑 PCR擴增儀Mastercycler T-Gradinet（德國Eppendorf公司），DYCZ-28A型電泳槽（北京市六一儀器廠），恒溫孵育箱。人全血DNA提取試劑盒（北京天根生物有限公司），Taq-DNA聚合酶、NruⅠ限制性內切酶（Promega公司）。

1.3 研究方法 2組均采空腹外周靜脈血2 mL，提取白細胞基因組DNA。采用聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測CXCL5基因啟動子區-156 G/C基因多態性。引物序列均查基因庫并參考文獻[3]設計，上游引物5′-CTCCTCCTGGCCACCCTCGC-3′，下游引物 5′-TCAAGCTTTG GGATGCTGGGGAA-3′（上海捷瑞生物工程有限公司合成）。PCR擴增片段長度114 bp，分離純化擴增產物，測序并與GenBank中CXCL5基因比較。以限制性內切酶NruⅠ進行消化，酶切產物用經15%聚丙烯酰胺電泳溴乙錠染色，凝膠自動成像系統觀察結果并成像。

1.4 統計學方法 采用SPSS 11.5軟件完成，計量資料用±s表示，兩個樣本比較采用t檢驗，偏態分布資料做自然對數轉換成正態分布后再行t檢驗。遺傳平衡吻合度檢驗用Hardy-Weinberg平衡法。各組間基因頻率、等位基因頻率比較采用行×列表χ2檢驗，并對基因型及等位基因頻率分布進行相對發病風險分析，計算比值比（odds ratio,OR）及其95%可信區間。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 擴增產物基因測序結果 擴增產物片段為114bp，將產物測序并與GenBank中CXCL5基因啟動子區-156 G/C的基因序列進行比較，與相應序列完全一致，見圖1～3。

Figure 1 G/G homozygous genotype圖1 G/G基因型

Figure 2 G/Cheterozygous genotype圖2 G/C基因型

Figure 3 C/Chomozygous genotype圖3 C/C基因型

2.2 2組CXCL5啟動子-156G/C位點基因型及等位基因頻率分布 CXCL5基因啟動子-156G/C的基因型分布分符合Hardy-Weinberg平衡，見表1。T2DM組和對照組基因型和等位基因分布上差異無統計學意義（均P>0.05），見表2。

Table 1 Hardy-Weinberg analysis表1 Hardy-Weinberg基因平衡檢驗（實際觀察值/理論值）

Table 2 CXCL5 polymorphism genotype and allelotype frequency in two groups表2 2組CXCL-5基因型及等位基因頻率分布

2.3 CXCL5-156G/C位點多態性 G/G基因型可被酶切為95 bp和19 bp片段，G/C基因型可被酶切為114 bp、95 bp和19 bp片段，C/C基因型不可被酶切，可見1條114 bp的電泳帶，見圖4。

Figure 4 The CXCL5-156G/CSNPgenotyping by PCR-NRUI digestion and PCR production圖4 CXCL5-156G/C基因擴增產物酶切電泳圖

3 討論

趨化因子能通過炎癥反應參與糖尿病與胰島素抵抗的發生發展，與其他機制共同加快糖尿病病程的進展。CXCL5/ENA-78參與炎癥、腫瘤、自身免疫病、超敏反應及獲得性免疫缺陷綜合征多種疾病的發生發展過程。CXCL5基因位于染色體4q13～q21，其中有2個單核苷酸多態性位點：啟動子區域的-156G＞C（rs352046），外顯子 398G＞A（rs425535），而啟動子區域-156G/C的基因多態性影響基因表達水平[4]。并且Zineh等[5]的研究表明-156位點攜帶C等位基因者其血漿CXCL5濃度顯著升高，并直接影響白細胞產生CXCL5。目前國內外關于CXCL5與2型糖尿病的相關性研究較少，Alfadda等[6]研究證實糖尿病患者血清CXCL5水平明顯高于對照組。

本研究顯示2型糖尿病組和對照組基因型和等位基因分布上差異無統計學意義，C等位基因并不增加糖尿病的發病率，提示CXCL5酶切位點基因多態性與T2DM發病有較弱的遺傳關聯性，研究結果與近期國外報道不一致。分析其可能的原因有：（1）樣本量有限，有待進一步擴大樣本量；在缺乏更大樣本的臨床研究資料之前，評價兩者之間的關系應慎重。（2）CXCL5在T2DM發病中所起的作用比較弱。（3）不同種族、地區和群體在遺傳和表型上存在異質性，CXCL5酶切位點的基因型在不同種族和群體中分布頻率不一。（4）T2DM是復雜性的多基因遺傳病，是遺傳因素與環境因素相互作用的結果。CXCL5單個基因多態性只能改變個體對疾病的易感性，其可能需與其他基因或環境因素共同影響疾病的發生。

CXCL5-156G/C位點的基因多態位點在國內文獻少見報道，因而筆者不能斷言CXCL5酶切位點的多態性與T2DM的發病無關。有待進一步加大樣本量，開展多地區、多種族人群的大規模前瞻性研究和譜系研究。

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[2]李秀鈞，鄔云紅.糖尿病是一種炎癥性疾病[J]?中華內分泌代謝雜志,2003,19(4):251-253.

[3]Hasani Ranjbar S,Amiri P,Zineh I.CXCL5 gene polymorphism association with diabetes mellitus[J].Mol Diagn Ther,2008，12(6):391-394.

[4]Amoli MM,Larijani B,Thomson W,etal.Two polymorphisms in the epithelial cell-derived neutrophil-activating peptide(ENA-78)gene[J].Dis Markers,2005,21(2):75-77.

[5]Zineh I,Aquilante CL,Langaee TY,etal.CXCL5 genepolymorphisms are related to systemic concentrations and leukocyte production of epithelial neutrophil-activating peptide (ENA-78)[J].Cytokine，2006,33(5):258-263.

[6]Alfadda AA,Alzoghaibi MA.Circulatory neutrophil chemokines in statin-treated diabetic patients[J].Saudi Med J,2008,29(4):584-588.