水蛭素對動脈內皮保護作用的實驗研究*

梁桂文 姜敏輝

水蛭是調節血脂、破血逐瘀的傳統中藥，其抗凝作用已經受到普遍認可。近年來有實驗研究顯示，小劑量水蛭具有保護血管內皮，促進內皮細胞生長的作用[1-2]。目前阿托伐他汀保護內皮作用已得到共識[3]。本研究旨在評價水蛭在動脈粥樣硬化形成過程中對動脈內皮的保護作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級健康雄性日本大耳白兔55只，體質量（2.4±0.2）kg，購于南通大學實驗動物中心。水蛭購自南通大學附屬醫院中藥房（過400目篩），阿托伐他汀由輝瑞公司饋贈，藥物送飼料廠加工入飼料給藥。飼料購自蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司。NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所（硝酸還原法），內皮素（ET）-1、前列環素（PG）F-1-α、血栓烷（TX）B2及 C反應蛋白（CRP）試劑盒購自上海滬峰化工有限公司。

1.2 方法 隨機選取7只為正常對照（A）組，予以普通飼料120 g/d喂養，模型組48只予以高脂飼料（1%膽固醇、5%蛋黃粉、5%豬油、89%基礎飼料）120 g/d喂養。9周后全部進行血脂檢測并在隨機選取模型組3只做病理觀察，確定模型建立成功后模型組隨機抽取40只分為4組，每組10只，繼續高脂飼料喂養，其中未處理組（B組）不加藥物；低劑量水蛭組（C 組）加入水蛭粉劑量 0.5 g/（kg·d）；高劑量水蛭組（D 組）加入水蛭粉劑量 1.5 g/（kg·d）；阿托伐他汀組（E 組）加入阿托伐他汀用量2.5 mg/（kg·d）。A組全部保留并繼續普通喂養。繼續喂養8周后各組均出現少量死亡，飼料A、B、C、D、E組進行入實驗的兔分別為6、6、8、8、7只，第 8周末，所有存活兔禁食12 h后采血5～8 mL，制備血清。模型制作成功標準參照文獻[4]。NO、ET-1、PGF-1-α、TXB2 及 CRP 的測定方法參照試劑盒說明書操作。總膽固醇 （TC）、低密度脂蛋白（LDL）采用全自動生化分析儀測定。采血結束后，將所有大耳白兔處死，取胸主動脈段大體觀察，采用LeicaQWin圖像分析系統匯總出斑塊面積并計算斑塊占動脈內皮總面積的百分比，取病變最嚴重處石蠟切片。

1.3 統計學方法 采用Stata 7.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料數據以均數±標準差（±s）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Scheffe法。計數資料采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，組間多重比較采用Dunn法。用LeicaQWin圖像分析系統進行圖像處理。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胸主動脈大體標本觀察 見圖1。A組胸主動脈內膜粉白色，表面光滑，動脈管壁彈性良好，無一例有動脈粥樣硬化斑塊或脂質條紋；B組內膜表面粗糙，彌漫增厚，管壁彈性差，易于斷裂，有明顯的斑塊形成，灰白色、大小不等、相連成片，平均斑塊面積達內膜總面積的74%；C、D、E組平均斑塊面積分別為45%、21%、20%。

2.2 胸主動脈組織形態學改變 A組血管內膜均正常，見圖2-1。余各組均出現了輕、重度粥樣斑塊，見圖2-2及圖2-3，成功建立大耳白兔動脈粥樣硬化模型。其中 B組 4例 （67%）、C組 4例（50%）、D 組 2例（25%）、E 組 1例（14%）可見典型粥樣斑塊病變。

2.3 各組血清學指標結果比較 各組TC、LDL及NO等差異均有統計學意義（P<0.01），其中D組與B組各項指標差異均有統計學意義 （P<0.001）；D組和C組 TC、LDL、ET-1及 PGF-1-α差異無統計學意義（P>0.05）；D組和E組除TC、LDL及ET-1差異有統計學意義外（P<0.05或P<0.01），其他各指標差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

Figure 1 Macroscopic observation of thoracic aorta in five groups圖1 各組胸主動脈標本大體觀察

Table 1 Comparison of serological detection index between four groups表1 各組血清學指標結果比較 （±s）

Table 1 Comparison of serological detection index between four groups表1 各組血清學指標結果比較 （±s）

*P < 0.05，**P < 0.01

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Figure 2 Thoracic aorta observed by optical microscope圖2 胸主動脈光鏡觀察（HE染色×100）

3 討論

本研究中大耳白兔動脈粥樣硬化模型造模成功，提示高脂可損傷動脈內皮，并導致動脈粥樣硬化發生，其可能在動脈粥樣硬化發生發展過程中起重要作用[3]。C、D斑塊面積低于B組，提示水蛭具有保護動脈內皮、延緩動脈粥樣硬化進展的作用。研究發現，血脂中LDL被氧化后參與形成泡沫細胞，還可損傷內皮，促進單核細胞及中性粒細胞黏附，促進平滑肌細胞增生及血小板黏附聚集，加劇炎癥反應等，是動脈粥樣硬化發生發展的重要原因[3,5]。本研究中C、D組血清TC和LDL均低于B組，差異有統計學意義，提示水蛭具有調節脂質代謝、保護內皮及延緩動脈粥樣硬化進程的作用。但D組的TC、LDL值均高于E組，差異亦有統計學意義，提示在調節TC和LDL方面水蛭與阿托伐他汀有一定差距。

前列環素（PG）I2和血栓烷（TX）A2在體外極不穩定，本研究中以測定其穩定的代謝產物PGF-1-α和TXB2代替，同時測定NO和ET-1，結果顯示，C、D組與B組比較，PGF-1-α和NO升高，TXB2、ET-1降低，差異有統計學意義，提示在內皮細胞保護方面它們具有相似的作用。李慎賢等[6]研究認為，血管內皮功能損傷在可見斑塊出現前很長時間已經形成，在內皮功能障礙時分泌的各項因子中以PGI2、NO降低和TXA2、ET-1升高最為顯著，其中TXA2能促進血小板聚集，收縮血管，ET-1是強烈的血管收縮劑，同時可促進平滑肌細胞增殖，二者的升高可進一步加劇病變的進展，而PGI2和NO為兩者的拮抗因子，對內皮細胞損傷起到一定的保護作用。

目前研究認為，CRP是炎癥反應因子，參與內皮損傷的炎癥反應過程，可加速動脈硬化；CRP表達水平高低可反應動脈硬化程度以及斑塊的穩定性[7-8]。本研究中D組CRP低于B組，表明水蛭能顯著降低血清中CRP水平。C、D組間CRP差異有統計學意義，而D組與E組比較差異無統計學意義，提示水蛭可抑制炎癥反應，作用與阿托伐他汀相似，從而改善動脈粥樣硬化。但水蛭保護動脈內皮的作用是否存在其他的作用機制尚待進一步深入研究。

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