注射硫酸軟骨素酶對大鼠脊髓損傷后腓腸肌乙酰膽堿酯酶的變化及運動功能的影響①

李洪鵬，白旭東，高杰，巴方，劉寧

脊髓損傷后神經再生和功能修復是當今醫學領域中的一大難題。脊髓損傷后，損傷周邊反應性膠質細胞增殖并分泌硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)[1-2]，CSPGs的糖鏈可以明顯抑制軸突再生，而硫酸軟骨素酶ABC可以通過降解其糖鏈而促進中樞神經的再生，進而促進大鼠脊髓損傷后神經元的修復，提高肢體的運動功能[3-4]。本實驗通過制作Wistar大鼠T10脊髓損傷模型，探討硫酸軟骨素酶ABC對脊髓損傷后肢功能的恢復及肌肉組織內乙酰膽堿酯酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 硫酸軟骨素酶ChABC：美國SIGMA公司；GENMED冰凍切片乙酰膽堿酯酶活性染色試劑盒：邁新公司。成年Wistar大鼠40只，雄性，清潔級，體重250~300 g，由中國醫科大學實驗動物部提供。

1.2 動物模型制作 6%水合氯醛6 ml/kg腹腔內注射麻醉(30 mg/kg)，背部剃毛，常規消毒，以第8~10胸椎棘突為中心行背部正中切口，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉，暴露棘突及椎板，顯微咬骨鉗咬除第8~10胸椎棘突和椎板，暴露脊髓，約長4~5 mm，在T10節段將脊髓右側半橫斷。以大鼠的健側下肢作為對照組(A組)，患側下肢隨機分為單純脊髓損傷組(B組，n=20)及術后注射硫酸軟骨素酶ABC組(C組，n=20)。B組在脊髓橫斷后，向脊髓損傷處注入0.1 mol/L PBS 3μl；C組在脊髓橫斷后，向脊髓損傷處注入0.5 U/μl硫酸軟骨素酶ABC 3μl。縫合傷口，術后每天2次給予青霉素2×105U肌肉注射，并按摩膀胱直至排尿反射建立。動物飼養室溫維持在25℃~30℃。

1.3 后肢運動功能評分 各組大鼠分別于術后3 d、7 d、14 d和28 d(各5只)采用BBB評分法進行后肢運動功能評分：將動物置于面積1 m2的平面場地，自由活動4 min，由2名熟悉BBB評分標準的非本組實驗人員觀察，記錄動物后肢運動情況，取平均值。

1.4 取材與標本制作 各組大鼠分別于BBB評分后取材。6%水合氯醛6 ml/kg腹腔內注射麻醉(30 mg/kg)，生理鹽水及4%多聚甲醛300 ml灌注固定30 min，游離并切取大鼠腓腸肌。4%多聚甲醛固定12 h，放入30%蔗糖磷酸緩沖液1~2 d，OTC包埋后在-20℃恒溫箱內行冠狀連續冰凍切片。切片厚10 μm。

1.5 AChE染色 應用GENMED冰凍切片乙酰膽堿酯酶活性染色試劑盒對標本進行染色：冰凍切片用清理液略洗，加工作液，入37℃培養箱孵育2 h，避免光照，再用清理液清洗1次，GENMED蘇木素復染試劑盒-GMS80067進行復染，中性樹脂封片，即刻在光學顯微鏡下觀察。

1.6 AchE活性分析 應用MetaMorph/OP10/BX41圖像分析系統采集圖像并分析AchE染色陽性光密度值(OD值)。

2 結果

2.1 BBB評分 所有動物在術前評分均為21分；術后即刻各組動物健側運動功能短暫降低后，很快恢復到21分，患側損傷后BBB評分為0。B組和C組均與A組有顯著性差異(P<0.01)。隨著時間的延長，B組與C組大鼠的BBB評分有增高的趨勢，總的評分有非常高度顯著性差異(F=531.275,P=0.000)。術后14 d、28 d，C組BBB評分均優于B組(P<0.05)。見表1。

2.2 腓腸肌內AChE的表達 各組大鼠健側腓腸肌運動終板區AchE為棕黑色、細顆粒狀亞鐵氰化銅沉淀，在冠狀切面上呈橢圓形或卵圓形，大小20~40μm，邊緣清晰(圖1)。而B組(圖2)和C組(圖3)腓腸肌運動終板區AchE陽性顆粒形狀多不規則，且面積較小，尤以7 d、14 d、28 d下降顯著。

圖像分析顯示：A組(健側)各時間段AChE的OD值無顯著性差異。而B組及C組OD值在損傷后與健側比較均明顯下降(P<0.01)，以B組下降更明顯。C組在損傷后14 d及28 d較B組有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組術后不同時間AChE的平均光密度

3 討論

脊髓損傷的病理生理機制非常復雜，近年來對脊髓損傷后微環境中的抑制因子研究較多。CSPGs在中樞神經發育過程中可調節神經細胞增生、遷徙、分化，軸突的生長和路徑選擇，以及突觸的形成和成熟[4]。脊髓損傷后，CSPGs的堆積可抑制神經細胞軸突的再生修復[5]。CSPGs是帶有多種糖鏈的蛋白聚糖，而對神經再生起抑制作用的主要因素是其糖鏈，因此本研究采用可以消化CSPGs葡胺聚糖鏈的ChABC。

BBB評分是由Basso等提出的一種脊髓運動功能評定法，用于評價大鼠脊髓損傷后肢體運動功能的恢復情況[6]。該評分標準包括許多動物行為細節和特征說明，分級較細致(0~21分)，評分與脊髓功能恢復有良好的一致性。

AChE主要存在于突觸間隙及運動終板，它可催化乙酰膽堿，使其水解為膽堿和乙酸。各種形式的AChE都能在脊髓運動神經元和骨骼肌細胞中找到[7]。AChE活性不僅可反映運動神經元的功能狀態[8]，而且終板區AChE對于神經肌肉接頭突觸功能和結構的維持也是必需的，所以終板區AChE含量能夠反映終板退變及再生情況[9-10]。

本研究顯示，脊髓損傷后，大鼠運動功能的恢復與乙酰膽堿酯酶表達一致，提示ChABC治療可以提高脊髓損傷后大鼠的后肢功能恢復，其機制可能是促進神經再生并修復運動終板。

ChABC治療不僅可以促進脊髓本身的神經再生和修復，阻止神經肌肉接頭以上的退行性改變，而且可以加強肌肉與脊髓神經的聯系，使遠端肢體進行形態與功能重塑。但ChABC裂解CSPGs促進神經再生的機制目前仍然未完全清楚。

目前還沒有一種方法能夠使脊髓損傷完全康復，脊髓損傷治療的研究不應只局限于損傷局部神經再生，更要重視遠端肌肉組織內運動終板的研究。綜合應用多種治療方法對恢復運動功能具有廣大的研究前景和應用價值。

[1]McKeon RJ,Schreiber RC,Rudge JS,et al.Reduction of neurite outgrowth in a model of glial scarring following CNS injury is correlated with the expression of inhibitory molecules on reactive astrocytes[J].J Neurosci,1991,11(11):3398-3411.

[2]Fawcett JW,Asher RA.The glial scar and central nervous system repair[J].Brain Res Bull,1999,49(6):377-391.

[3]Bradbury EJ,Moon LD,Popat RJ,et al.Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury[J].Nature,2002,416(6881):636-640.

[4]Fouad K,Dietz V,Schwab ME.Improving axonal growth and functional recovery after experimental spinal cord injury by neutralizing myelin associated inhibitors[J].Brain Res Rev,2001,36(23):204-212.

[5]Lemons ML,Howland DR,Anderson DK.Chondroitin sulfate proteoglycan immunoreactivity increases following spinal cord injury and transplantation[J].Exp Neurol,1999,160(1):51-65.

[6]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].Neurotrauma,1995,12(11):1-21.

[7]Legay C.Why so many forms of acetylcholinesterase?[J].Microsc Res Tech,2000,49(1):56-72.

[8]Arikawa-Hirasawa E,Rossi SG,Rotundo RL,et al.Absence of acetylcholinesterase at the neuromuscular junctions of perlecan-null mice[J].Nature Neurosci,2002,5(2):119-123.

[9]Martinez-Penay Valenzuela I,Hume RI,Krejci E,et al.In vivo regulation of acetylcholinesterase insertion at the neuromuscular junction[J].J Biol Chem,2005,280(36):31801-31808.

[10]Martinez I,Valenzuela P,Akaaboune M.Acetylcholinesterase mobility and stability at the neuromuscular junction of living mice[J].Molecu Biol Cell,2007,18:2904-2911.