藥物和行為干預對缺血缺氧性腦損傷大鼠功能恢復的影響①

侯梅，楊會娟，姜艷平

缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是早產及低出生體重兒神經系統殘疾的重要原因，嚴重影響著患兒、家庭和社會。單唾液酸神經節苷脂(GM1)和神經生長因子(NGF)作為神經營養藥物被廣泛用于HIBD后遺癥患兒的臨床治療，其療效、用藥方法有待進一步驗證。

1 資料和方法

1.1 動物模型 選擇2日齡SD大鼠，雌雄不限。抽取7只入假手術組。其余幼鼠參照Han以及改良Rice法[1-2]制作腦室周圍白質軟化(PVL)動物模型：分離、結扎、切斷左側頸總動脈，入自制密封艙，通入6%O2+94%N2混合氣體4 h，氧濃度范圍為(6±0.3)%。觀察模型制作后24 h大鼠活動情況，將能夠正常吮乳的48只乳鼠分為：GM1治療組、NGF治療組、藥物聯合(GM1+NGF)治療組、行為干預治療組、藥物聯合+行為干預治療組、模型對照組，每組8只。分組后，所有幼鼠由母鼠自由哺乳，單組單籠，每天更換干刨花，保持環境干燥。幼鼠在籠里自由活動，自然光環境生長。

1.2 干預措施

1.2.1 藥物干預 GM1(博司捷)：黑龍江哈爾濱醫大藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20060422；注射用鼠NGF(金路捷)：武漢海特生物制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字S20060051。采用腹腔內藥物注射，自4日齡開始，每日1次連續7 d。藥物治療方案見表1。對照組采用等量生理鹽水腹腔內注射。

表1 實驗動物腹腔內注射藥物治療方案

1.2.2 行為干預 行為干預自15日齡開始，共持續14 d。干預內容包括：①感覺促進訓練：用硬毛刷刷右側上下肢，按肢體長軸方向由近端至遠端，加壓快速刷4個8拍，每天1次；②肢體協調性及肌力訓練：15日齡大鼠眼睛已睜開，放置于轉籠里活動15 min/d，必要時給予夾尾刺激，使其轉籠；③游泳訓練：放置于水深約30 cm的溫水槽(80×50×55 cm)中，水面離槽口20 cm左右，避免大鼠跳出水槽。用木棒驅趕大鼠在水中游泳10~15 min。

1.3 行為學測試 大鼠30日齡(相當于人類2~5歲)時進行神經行為學檢測。

1.3.1 懸吊試驗 大鼠前爪抓住一根水平懸吊的尼龍繩(直徑約0.4 cm)，尼龍繩長50 cm，離開桌面75 cm。記錄大鼠在繩上的時間。評分標準：1分：<10 s，2分：10~30 s，3分：30 s~2 min，4分：2~5 min，5分：>5 min；當大鼠出現雙上肢沿繩橫走或屈曲軀干試圖使下肢抓繩時，每項另加0.5分。

1.3.2 斜坡試驗 將大鼠頭向下倒置于45°的斜面上，記錄轉頭向上>135°所需要的時間，取3次計算平均值。

1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行處理。結果以(±s)表示。對于正態分布的計量資料，用單因素方差分析(ANOVA)進行顯著性檢驗，需進行兩兩比較時，應用q檢驗。析因設計資料采用相應的方差分析進行比較。所有假設檢驗顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 生長情況 1日齡及4日齡各組大鼠體重無顯著性差異(P>0.05)。10日齡各組大鼠間體重有顯著性差異(P=0.032)，NGF組大鼠體重高于其他各組(P<0.05)，而其余各組間無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠體重比較(g)

2.2 懸吊實驗 除NGF組外，其他各組動物成績均高于模型對照組(P<0.05)；各實驗組成績均低于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；藥物聯合+行為干預組成績優于GM1組、NGF組及藥物聯合組(均P<0.05)。見表3。

田歌依然冷冷地回絕：“沒什么好談的。你不走，我就走?！彼加暧行┥鷼饬?。他憤憤地看了妻子一眼，然后離開了。

2.3 斜坡實驗 各治療組成績均優于模型對照組(均P<0.05)；除藥物聯合+行為干預組外，其余各組成績均較假手術組低(均P<0.05)；行為干預組、藥物聯合+行為干預組的成績優于GM1、NGF及藥物聯合組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠行為學測試比較

2.4 析因設計分析

2.4.1 懸吊實驗 GM1與NGF無交互效應(F=1.620,P=0.214)；GM1存在主效應(F=5.185,P=0.031)，NGF無主效應(F=2.322,P=0.139)。藥物聯合治療及行為干預無交互效應(F=0.348,P=0.560)。藥物聯合治療(F=5.887,P=0.022)和行為干預(F=14.467,P=0.001)均存在主效應。

2.4.2 斜坡實驗 GM1與NGF無交互效應(F=6.546,P=0.160)； GM1(F=22.299,P=0.000)和 NGF(F=21.386,P=0.000)均存在主效應。藥物聯合治療與行為干預存在交互效應(F=12.241,P=0.002)，藥物聯合治療(F=25.035,P=0.000)及行為干預(F=8.548,P=0.000)均存在主效應。

3 討論

未成熟HIBD的細胞分子學及生物化學機制包括[3]：①缺氧缺血后腦灌注及代謝的變化；②細胞毒性機制；③缺氧缺血后神經元死亡的機制；④基因表達的改變：熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)生成上調，神經營養因子的分泌等。

2日齡大鼠的腦組織處于少突膠質細胞前體細胞發育時期，相當于人類妊娠24~32周胎兒發育時期[4]。此階段出生的活產兒中，PVL的發生率約為2‰~4‰，且隨著出生胎齡的降低而升高[5]。

研究證實[6-8]，中樞神經系統具有高度的可塑性，主要表現為突觸的形成、結構及功能的調節。早期給予豐富環境、各種感覺運動刺激、神經營養因子等均能夠增強神經可塑性。GM是組成細胞膜結構和維持膜功能的基本物質，外源性GM1能夠透過血腦屏障，嵌入膜結構中，調節膜介導的細胞功能，啟動受損后潛在的代償機制，促進神經重構，保護未受損害的神經組織，阻止損害進一步發展[9]。NGF不但具有促進神經元原有軸突的出芽、分枝及生長的功能[10]，而且還能夠促進那些未長出軸突的神經干細胞在神經元分化過程中向極化狀態轉變，并增加生長錐的生成，增加分化后神經元軸突的數量。

本研究通過行為學評分觀察神經營養藥物對大鼠腦功能的影響，結果表明，單一藥物治療即可取得滿意結果，聯合用藥并不能增加療效。本實驗中，單純NGF治療在改善上肢肌力以及隨意運動能力(懸吊試驗)方面沒有顯示療效，原因可能與該組動物的體重增長較其他各組快，影響了懸吊實驗測試結果有關。

臨床上，運動療法是改善HIBD后遺癥患兒軀體功能最主要的治療方式。Jones對實驗動物進行了行為干預與突觸可塑性之間的相關性研究，發現大鼠前肢感覺運動皮質損傷后，綜合的復雜運動技能訓練要比重復性簡單運動更能刺激大腦皮質突觸的發生、促進運動功能恢復[14]。行為干預能夠增強感覺輸入，改善神經元的微環境，刺激多種神經營養因子的分泌，誘導神經前體細胞分裂和增殖[15-16]，從而促進損傷修復。我們的觀察顯示，單純行為干預及聯合藥物治療均能夠明顯提高實驗動物的肌力、隨意運動以及軀體的平衡和協調功能(斜坡試驗)，并存在協同效應，證實了臨床運動療法的價值。

本實驗提示，GM1及其與NGF聯用都能夠明顯改善實驗動物的肌力和隨意運動以及軀體平衡和協調功能；對于NGF，本次實驗只發現了其對軀體平衡和協調功能有改善，兩者聯用較單藥治療并未表現出明顯優勢，提倡單藥治療。行為干預能夠提高實驗動物的肌力和隨意運動能力、改善實驗動物的軀體協調及平衡功能，聯合藥物治療可取得協同效應。

[1]Back SA,Lou NL,Borenstein NS,et al.Late oligodendrocyte progenitors coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury[J].J Neurosci,2001,21(4):1302-1312.

[2]Rice JE 3rd,Vannucci RC,Brierley JB.The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat[J].Ann Neurol,1981,9(2):131-141.

[3]Vexler ZS,Ferriero DM.Molecular and biochemical mechanisms of perinatal brain injury[J].Semin Neonatol,2001,6(2):99-108.

[4]Fukuda S,Kato T,Kakita H,et al.Hemodynamics of the cerebral arteries of infants with periventricular leukomalacia[J].Pediatrics,2006,117(1):1-8.

[5]Bajwa NM,Berner M,Workey S,et al.Population based age stratified morbidities of premature infants in Switzerland[J].Swiss Med Wkly,2011,141:w13212.

[6]Klinstsova AY,Greenough WT.Synaptic plasticity in cortical systems[J].Curr Opin Neurobiol,1999,9(2):203-208.

[7]Kreisel SH,Hennerici MG,Bazner H.Pathophysiology of stroke rehabilitation:the natural course of clinical recovery,use-dependent plasticity and rehabilitative outcome[J].Cerebrovasc Dis,2007,23(4):243-255.

[8]Navarro X,Vivo M,Valero-cabro A.Neural plasticity after peripheral nerve injury and regeneration[J].Prog Neurobiol,2007,82(4):163-201.

[9]Wu G,Lu ZH,Obukhov AG,et al.Induction of calcium influx through TRPC5 channels by cross-linking of GM1 ganglioside associated with alpha beta1 integrin initiates neurite outgrowth[J].J Neurosci,2007,27(28):7447-7458.

[10]Panni MK,Cooper JD,Panni MK,et al.Ganglioside GM1 potentiates NGF action on axotomised medial septal cholinergic neurons[J].Brain Res,1998,812(1-2):76-80.

[11]Huang F,Liu Z,Liu H,et al.GM1 and NGF modulate Ca2+homeostasis and GAP43 mRNA expression in cultured dorsal root ganglion neurons with excitotoxicity induced by glutamate[J].Nutr Neurosci,2007,10(3-4):105-111.

[12]Huang F,Dong X,Zhang L,et al.GM1 and nerve growth factor modulate mitochondrial membrane potential and neurofilament light mRNA expression in cultured dorsal root ganglion and spinal cord neurons during excitotoxic glutamate exposure[J].J Clin Neurosci,2010,17(4):495-500.

[13]Duchemin AM,Neff NH,Hadjiconstantinou M.GM1 increases the content and mRNA of NGF in the brain of aged rats[J].Neuroreport,1997,8(17):3823-3827.

[14]Jones TA,Chu CJ,Grande LA,et a1.Motor skills training enhances lesion-induced structural plasticity in the motor cortex of adult rats[J].J Neurosci,1999,19(22):10153-10163.

[15]袁華,龍華,李玲.康復訓練對腦梗死大鼠皮質S-100、GFAP和Nestin表達的影響[J].中華物理醫學與康復雜志,2003,25:520-523.

[16]Binemaskie J,Corbett D.Enriched rehabilitative training promotes improved forelimb motor function and enhanced dendritic growth after focal ischemic injury[J].J Neurusci,2001,21(14):5272-5280.