莫諾苷對二磷酸腺苷誘導兔血小板聚集鈣離子的影響①

艾厚喜，左瑋,，王曉鋒，張麗，季暉，陳乃宏，王文

心腦血管疾病發病率在日益提高，給社會和國家帶來巨大負擔，抗血小板聚集藥物在防治心腦血管疾病過程中起著重要作用。20世紀50年代以后，采用活血化瘀法治療心腦血管疾病等取得引人注目的進展。研究活血化瘀中藥的活性成分，進而開發出新藥，是中藥現代化研究的課題。

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)是山茱萸科植物，性微溫，味酸、澀，歸肝、腎經，具有補益肝腎，澀精固脫的作用。環烯醚萜苷是本室研究得到的山茱萸有效成分。對山茱萸環烯醚萜苷進一步分離，得到莫諾苷(morroniside)。前期研究發現，莫諾苷對SH-SY5Y神經細胞具有抗氧化、抗凋亡等保護作用[1-4]；莫諾苷能減小大鼠局灶性腦缺血再灌注模型腦梗死體積[5]，抑制皮層脂質過氧化作用[6]。此外，莫諾苷能顯著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和血小板活化因子(platelet activation factor,PAF)誘導的兔血小板聚集的作用，尤其對ADP的抑制作用選擇性強[7]。血小板聚集和胞漿中游離Ca2+濃度的升高密切相關。本文通過體外研究莫諾苷在ADP誘導血小板聚集后對Ca2+含量的影響，進一步從分子角度探討莫諾苷抗血小板聚集的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備，高效液相分析，純度約98.5%。乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid,ASA)為SIGMA公司產品，用時用蒸餾水溶解，以0.1 mol/L NaHCO3調pH至7.0左右，再加蒸餾水稀釋到所需濃度。

1.2 試劑 ADP：SIGMA公司，配制成7.5 mg/ml儲存液，分裝，-20℃密封保存，臨用前稀釋，終濃度為10 μmol/L；Fura-2 AM：美國Quantikine公司。

1.3 動物及儀器 新西蘭大耳白兔：體重(3.0±0.5)kg，SPF級，由北京開源兔業養殖場提供，合格證號SCXK(京)2006-0005；SC-2000 Microfuge低溫離心機：美國BECK-MAN公司；IMT22型全自動酶標儀(LP400型)：法國Diagnostic Pasteur。

1.4 方法

1.4.1 血小板的制備[8]取新西蘭大耳白兔，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈緩慢注射麻醉，固定于兔臺上，頸總動脈插管取血，與3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑按9∶1(V/V)混勻。230 g離心10 min后取上清液即富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)，再將PRP 800 g離心15 min，得沉淀即血小板。

1.4.2 負載血小板懸液的制備 血小板經無鈣Hepes buffer輕輕洗滌2次，然后用無鈣Hepes buffer重懸，調血小板的密度為(400～500)×109/L；加入終濃度2μM的Fura-2 AM，37℃恒溫避光振搖負載1 h。

1.4.3 血小板Ca2+的測定 經500 g離心負載血小板懸液，取沉淀用無鈣Hepes buffer輕輕洗滌2次，去除多余的Fura-2 AM；再用無鈣Hepes buffer重懸，加入含鈣Hepes buffer，使其Ca2+終濃度為1 mmol/L。然后加入各組藥品溶液，莫諾苷低、中、高劑量組分別3 mg/ml、6 mg/ml、12 mg/ml，空白對照組生理鹽水，ASA組0.5 mg/ml。體外作用5 min；再加入ADP(終濃度為10μM)誘導聚集。雙波長熒光分光光度計上作熒光測定，固定發射波長于510 nm，采用改變波長的時間掃描，激發波長分別固定在340 nm和380 nm，記錄5 min內Fura-2在激發波長340 nm和380 nm處的熒光強度比值，即F340/F380值[9]。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計處理，結果以(±s)表示。應用一般線性模型(general linear model,GLM)的重復測量和多變量過程對重復測量數據進行重復測量方差分析和多元方差分析，并進行不同時間點和不同組間的兩兩比較。藥物對Ca2+濃度變化的影響用F340/F380比值對時間變化表示。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 球形檢驗 Mauchly球形檢驗結果P＞0.05，說明重復測量數據之間實際上不存在相關性，資料滿足Huynh-Feldt條件，可以用重復測量設計資料的單變量方差分析處理資料。見表1。

2.2 分析時間、分組因素的作用以及時間和分組之間的交互作用 個體內變異部分的計算結果顯示，時間因素對Ca2+濃度有統計學意義(P＜0.05)，說明Ca2+濃度有隨時間變化的趨勢；時間和分組的交互作用有統計學意義(P＜0.05)，說明時間因素的作用隨著分組的不同而不同。個體間變異部分有統計學意義(P＜0.05)，說明分組因素起作用。見表2。

表1 Mauchly球形檢驗結果

表2 主體內效應的檢驗

2.3 每個時間點上5個分組之間的兩兩比較 對1～5 min內5個時間點各組的F340/F380比值進行兩兩比較。與空白對照組相比，在1～5 min內ASA均能顯著降低由ADP誘導血小板聚集引起的F340/F380比值的升高(P＜0.001)。莫諾苷的低、中、高劑量組均能降低ADP誘導血小板聚集引起的F340/F380比值升高，并且具有濃度依賴性，其中中、高劑量組比ASA組的作用還強。說明莫諾苷可以顯著降低ADP誘導兔血小板聚集后Ca2+濃度的升高(P＜0.001)。見表3。

表3 不同時間點各組F340/F380值比較

3 討論

血小板聚集和胞漿中游離Ca2+濃度的升高密切相關。Ca2+是血小板聚集和釋放反應中重要的物質基礎，作為活化信息的傳遞者通過活化磷脂酶A2作用于磷脂產生血小板活化的主要介質如血栓烷等[10-11]。靜息的血小板胞質內的Ca2+濃度為100 nmol/L，在刺激劑的作用下其濃度可增1000 nmol/L以上。胞質內Ca2+濃度升高可引起血小板變形、分泌和聚集。Ca2+可通過很多途徑如Ca2+-降鈣素依賴性蛋白激酶、Ca2+依賴性蛋白激酶PLC、PLA和PKC激活血小板[12]。

本文著重通過測定莫諾苷是否能夠抑制ADP誘導血小板聚集后引起的Ca2+的上升，探討莫諾苷抗血小板聚集的可能機制。從實驗數據來看，莫諾苷可以不同程度抑制ADP誘導兔血小板聚集后Ca2+的上升。從分子機制證明莫諾苷可能通過這一機制，發揮兔體外抗血小板聚集的作用。但是體內抗凝機制十分復雜，涉及到多種因素，因此對于莫諾苷抗凝機制還有待于進一步做更詳盡的研究。

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