PGC－1α基因Gly482Ser多態性與2型糖尿病前期的相關性研究

鄧德耀，袁文麗，馮 倩，劉春林，趙東巖，李顯麗，高宗鷹，徐紅云，方 芳，李奕平

（云南省第二人民醫院1.檢驗科；2.內分泌科，云南 昆明650021）

過氧化物增殖激活受體協同激活子（PPAR－γ coactivator 1α，PGC－1α）是近年來發現的一種轉錄協同激活子，在多種糖尿病研究模型及部分人種中可見其多態性與2型糖尿?。╰ype 2diabetes mellitus，T2DM）相關，認為PGC－1α可能參與了糖尿病發?。?－4］。糖尿病前期又 稱糖調節受損（Impaired glucose regulation，IGR）是指血糖處于正常與糖尿病之間的時期，包括空腹血糖受損（Impaired free glucose，IFG）和糖耐量受損（Impaired glucose tolerance，IGT）以及兩者合并存在三種狀態［5］。在T2DM被確診以前，患者都要經歷糖尿病前期階段。患者在這一階段發展成為糖尿病的可能性明顯提高，并且出現大血管和微血管并發癥的危險明顯升高，是糖尿病自然病程的重要階段，也是預測糖尿病的臨床標志。然而，大規模流行病學研究發現并非所有的糖尿病前期人群均進展為2型糖尿病。因此本研究首次應用高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）方法，完成了對云南省昆明地區361例糖尿病前期人群PGC－1α基因Gly482Se多態性位點（rs8192678）進行分析，在基因水平為預測糖尿病前期人群向糖尿病的轉歸提供了客觀依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究選擇了云南省昆明地區的具有醫療記錄的361例糖尿病前期人群（IGR）、430例2型糖尿病患者（T2DM）和446例性別和年齡相匹配的OGTT正常的健康志愿者（NGT）。糖尿病及糖尿病前期診斷標準采用WHO1999年診斷標準（內科學第7版）。正常對照系進行糖尿病普查和篩選的隨機人群中確定的非糖尿病個體，無直接血緣關系且無糖尿病家族史。

1.2 主要試制和儀器

紫外分光光度計 （Becman公司），PCR擴增儀（Perkin－Elmer公司），DYY－10C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統（美國BIO－RED公司），LightCycler 480熒光定量分析儀（德國羅氏診斷有限公司），即用PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程有限公司），LightCycler 480高分辨率熔解擴增試劑盒（德國羅氏診斷有限公司）。

1.3 實驗方法

（1）臨床資料收集：所有研究對象采用統一調查表進行調查，內容包括一般情況、個人史、家族史、吸煙飲酒史以及藥物使用情況等。每個個體均測量身高、體重、腰圍、臀圍，根據如下公式計算體重指數（BMI）：BMI＝體重／身高2（kg／m2）。血糖、血脂、肝腎功等均使用日立7600全自動生化分析儀檢測。

（2）基因組DNA制備：用2%EDTA＋K2抗凝真空管采集外周靜脈血2ml，經典酚－氯仿－異戊醇法提取基因組DNA，紫外分光光度計對DNA濃度進行測定，每個樣本測定兩次，取其平均值。如果兩次誤差超過10%，則進行第3次測定，然后取兩個相近數值的平均值，最后將所有DNA樣品稀釋至終濃度20ng／μl。

（3）引物的合成：根據Primer3.0軟件設計PGC－1α基因的引物。上游引物序列：5＇－CAGTCAAGCTGTTTTTGACGAC－3＇；下游引物序列：5＇－TCACTTTCATCTTCGCTGTCAT－3＇。引物由上海生工生物工程有限公司合成，用HPLC純化。

（4）PCR：在PCR擴增儀上進行普通PCR反應。PCR體系包括20ng的基因組DNA、1×PCR Master mix（已含MgCl2）、500nmol的正反向引物，并用PCR級別的水補足至20μl。反應條件為：94℃預變性4min；94℃變性1min，55℃退火1 min，72℃延伸1min，共30個循環；72℃在延伸7 min，并于4℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠成像系統觀察。

（5）高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）分析方法檢測PGC－1α基因Gly482Ser G＞A基因型：普通PCR反應擴增特異性條帶成功后，在Light Cycler 480熒光定量分析儀上采用HRM方法進行PGC－1基因Gly482Ser G＞A多態性分析。PCR和HRM分析均在Light Cycler 480上進行。PCR體系包括10ng的基因組DNA、1×PCR Master mix、2mmol／L MgCl2、200nmoL的正反向引物，并用PCR級別的水補足至20μl。PCR條件：95℃預變性10min后行觸底PCR，即95℃10 s，65℃－55℃退火15s，72℃10s，55個循環，其中前十個循環65℃－55℃，每個循環退火溫度降一度，后45個循環退火溫度維持55℃。HRM分析條件：95℃1min，40℃1min，熔解曲線數據收集從65℃到95℃，溫度上升率為1℃／s，且每升高l℃進行15次數據采集。最后40℃冷卻10s。應用gene scanning軟件進行實時數據檢測和分析。隨機選取不同熔解曲線的產物共20例測序驗證基因型結果。以測序得到的野生純合子GG、突變雜合子GA和突變純合子AA分別作為標準品，分析其它DNA樣本基因型。

1.4 統計學方法

計量資料用“均數±標準差”表示，如果方差不齊或者不符合正態分布均進行數值轉換，應用獨立樣本t檢驗兩兩比較三組之間人口學和生化指標的差異；基因型等計數資料的比較以及Hardy－Weinberg平衡檢驗均使用χ2檢驗或Fisher’s檢驗。所有數據均利用SPSS17.0軟件處理，雙側P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

361例IGR和430例T2DM的平均年齡分別為54.01±10.92歲和53.74±12.00歲（P＝0.852）。和2型糖尿病組比較，IGR組人群僅有BMI明顯降低（P＝0.018），而 WBC、TG、TC、HDL－C和LDL－C均無顯著性差異（表1）。

根據熔解曲線熒光和峰值的差異來有效區分不同標本PGC－1α基因482位點多態性，結果由Light Cycler 480gene scanning軟件輸出，該位點的基因型明顯的分為GG、GA、AA三型，且與測序結果一致（圖1、圖2）。

表1 IGR組和T2DM組個體一般情況比較

圖1 Light Cycler 480高分辨率熔解曲線

PGC－1α基因482位點多態性的基因型經遺傳平衡定律檢驗符合Hardly－Weinberg平衡法則，提示研究對象具有群體代表性。由表2可見，AA純合子在T2DM組中的頻率0.209，在IGR組中為0.152，前者頻率高于后者，但差異無統計學意義（P＞0.05）；G等位基因和A等位基因頻率在兩組間比較，IGR組人群擁有較低的A等位基因頻率，且差異具有顯著性意義（表2、圖3）。而IGR組與NGT組比較，基因型及等位基因分布頻率均無顯著性差異（表3、圖4）。

表2 T2DM組和IGR組PGC－1α基因型與等位基因分布頻率

表3 NGT組和IGR組PGC－1α基因型與等位基因分布頻率

IGR組PGC－1α基因482位點GG基因型和GA＋AA基因型的表型間的BMI、TC、HDL－C和LDL－C比較，P均＞0.05，差異無統計學意義（表4）。IGR包括了IFG、IGT以及兩者合并存在三種狀態，為減少影響因素，本研究在剔除了IFG和IGT合并存在的IGR人群后，分別對IFG人群和IGT人群進行PGC－1α基因Gly482Ser多態性與臨床變量的深入分析。研究發現，IGR組IFG人群PGC－1α基因482位點多態性GG基因型和GA＋AA基因型的臨床變量差異均無統計學意義（P＞0.05）。而在IGT人群中，含 A的基因型（GA＋AA）則表現出更高的餐后2小時血糖 （PBG）水平，且具有統計學差異（P＝0.027），而BMI、TC、HDLC和LDL－C水平在GA基因型和GA＋AA基因型之間均無顯著性差異（表5）。

表4 IGR組PGC－1α基因Gly482Ser多態性與臨床變量

表5 IGR組IFG人群和IGT人群PGC－1α基因Gly482Ser多態性與臨床變量

圖2 PGC－1α基因482位點測序圖

圖3 等位基因在NGT、IGR及T2DM三組間分布頻率圖

3 討論

T2DM是多基因遺傳病，至今尚未從基因角度完全闡明其發病機制。隨著疾病基因組學研究的深入，作為第3代遺傳標記的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）篩查及其與疾病相關性分析近年倍受關注。SNP是指在基因組水平上，因單個核苷酸的轉換、顛換、插入或缺失而形成的一種與疾病群體易感性和個體表型差異相關，甚至參與某些疾病發病過程的DNA序列改變。PGC－la是PGC－1家族的第一個成員。PGC－1α可輔助激活核受體PPAR－α和PPAR－γ及肌肉增強因子2C（muscle enhance factor 2C，MEF2C）等一系列與糖脂代謝有關的基因轉錄，是機體能量代謝的重要調控者。MEF2C是骨骼肌葡萄糖轉運子（glucose transporter，GLUT4）的上游調控子，經 PGC－1α輔助激活后調節骨骼肌對葡萄糖的攝取過程。PGC－1α基因中部403－570區域（稱為“MEF2C結構域”）可以與MEF2C多肽鏈的第93－174aa區域特異結合，482位點恰好位于該結構域的中心，此位點的錯義突變有可能影響PGC－1α與MEF2C的結合，進而影響MEF2C對下游基因GLUT4表達的調控［6］。國內也有學者研究發現，PGC－1α基因Gly482Ser多態性與T2DM相關，他們認為PGC－1α基因可能參與了糖尿病發病［7－8］。然而，在糖尿病前期人群中卻少見Gly482Ser多態性的相關研究。鑒于此，本課題首次應用HRM方法對云南省昆明地區361例糖尿病前期人群進行PGC－1α基因Gly482Ser多態性進行分析。

傳統用于檢測SNP的方法是限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR－RFLP）技術，但其操作繁瑣、耗時長、容易交叉污染、達不到高通量的要求，而且溴化乙錠致癌性強。其它用于檢測SNP的方法也都有一定的局限性，如Taqman探針技術則價格昂貴，直接測序法雖然是目前檢測基因型的金標準，但其步驟多而分散、工作量大、周期長、成本較高，不適合臨床和實驗室常規檢測。HRM技術操作簡便、快速，可實現高通量的閉管操作、避免污染，且成本低、靈敏度高、結果準確可靠，具有極強的可操作性，已成為遺傳學、方法學研究和應用的熱點，有望成為分子診斷的常規方法［9－10］。本實驗通過HRM方法對PGC－1α基因Gly482Ser多態性進行檢測，其結果與直接測序一致，為今后HRM檢測方法的廣泛應用提供參考依據。我們測定1237例受試者，結果顯示，rs8192678位點AA純合子在云南省昆明地區430例T2DM中的頻率為0.209，在361例糖尿病前期人群中為0.152，兩組間無顯著性差異；G等位基因和A等位基因頻率在兩組間比較，IGR組人群擁有較低的A等位基因頻率，且差異具有顯著性意義。而IGR組與NGT組比較，基因型及等位基因分布頻率均無顯著性差異。本研究觀察到PGC－1α基因482位點A等位基因（包括GA和AA型）更易出現在2型糖尿病人群，且A等位基因頻率與2型糖尿病的發生呈正相關?？梢酝茰y，PGC－1α基因482位點A等位基因可能是糖尿病前期人群疾病進展的一個分子標記。也就是說，含有A等位基因的糖尿病前期人群更易進展為2型糖尿病。

IGR組PGC－1α基因482位點GG基因型和GA＋AA基因型的表型差異無統計學意義。此結果提示除PGC－1α基因482位點A等位基因外，還可能存在其它的未知因素共同影響糖尿病前期人群血脂的代謝水平。PGC－1α基因482位點A等位基因，作為糖尿病前期人群疾病進展的分子標記之一，也許并未對糖尿病前期人群可能出現的血脂紊亂做出重要的貢獻，而僅是其發生的因素之一。本研究還發現，在IGT人群中，含A的基因型（GA＋AA）表現出更高的PBG水平，且具有統計學差異，而BMI、TC、HDL－C和 LDL－C水平在野生型（GA）和突變型（GA＋AA）之間均無顯著性差異。這說明PGC－1α基因482位點A等位基因（包括GA和AA型）更易合并餐后高血糖，且A等位基因頻率與餐后血糖值呈正相關。這可能與PGC－1αA等位基因易引起胰島β細胞葡萄糖刺激的胰島素分泌障礙有關，其可能機制為PGC－1α可通過上調胰島β細胞解偶聯蛋白2表達，使線粒體呼吸鏈解偶聯，ATP／ADP比率下降，通過影響鉀離子通道，進而抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌［11］。

隨著生活方式的改變，T2DM發病率逐年升高，其后備軍即糖尿病前期人群數量亦是與日俱增，作為一個多基因遺傳性疾病，基因在其發病中的作用至關重要。隨著對PGc－1a基因研究的深入，其在調節能量代謝和諸多基因轉錄中具有重要作用。鑒于此，我們仍然迫切需要尋找一些分子標記，從而對糖尿病前期人群疾病的轉歸進行預測，以期達到早期診斷和治療的目的。本課題只是在應用HRM方法的基礎上對較小樣本糖尿病前期人群PGC－1α基因Gly482Ser進行了多態性分析，并推測含有A等位基因的糖尿病前期人群更易合并餐后高血糖，更易進展為2型糖尿病。當然，精確的評估尚需通過大規模臨床試驗和流行病學研究予以證實。

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