VEGF和端粒酶檢測對惡性腹水的診斷價值

于艷芳，段曉輝，張 勇，張瑞英，賈力品，崔星亮，裴志萍

（1.河北工程大學附屬醫院 血液內科，河北 邯鄲056002；2.河北工程大學醫學院；3.邯鄲市第二醫院）

很多原因可以引起腹水，臨床醫生對腹水性質的診斷比較困難。在確定腹水存在后，明確腹水的良性、惡性一直困擾著臨床醫生，查找到癌細胞對明確診段的具有重要意義，但其陽性率尚不盡人意。目前，判斷腹水性質的報道很多，方法也不相同。因此，建立新的能診斷腹水良性、惡性的診斷指標，對腹水性質的判定、疾病診斷和治療具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 選擇2009年10月—2010年12月在河北工程大學附屬醫院住院確診為惡性腹水的患者60例（均有腹膜轉移）作為病例組，男35例，女25例，平均年齡（56±12.5）歲，其中肝癌28例，胃癌10例，卵巢癌13例，結腸癌8例，胰腺癌1例。選擇同一時期入院確診為良性腹水75例患者作為對照組，男40例，女35例，平均年齡（50±12）歲，其中肝硬化37例，結核性腹水18例，心源性腹水8例，低蛋白血癥4例，良性腹膜間皮瘤3例。兩組患者年齡、性別方面比較無顯著性差異（P＞0.05），符合統計學要求。

1.2 主要儀器及試劑 細胞制片機為HZ－36A型全自動液基薄層細胞檢測技術（TCT）制片機；羊抗人端粒酶多克隆抗體和鼠抗人血管內皮細胞生長因子（VEGF）多克隆抗體購自北京中山生物技術有限公司；含兔抗羊二抗和兔抗鼠二抗的SABC試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。

1.3 檢測方法及結果判定 確定分組患者后，于入院次晨無菌穿刺腹腔收集腹水150－200ml。在收集腹水前均未接受過任何治療。樣品于4℃加1.077g／ml的細胞分離液，3 000r／min離心20 min，吸棄上清，PBS重懸沉淀，1 600r／min離心6 min，洗細胞2次，沉淀物用細胞保存液重懸加入細胞保存瓶，置于－80℃保存。采用全自動TCT制片機制片，免疫細胞化學方法SABC檢測VEGF和端粒酶。

1.4 結果判定 染色結果為端粒酶定位于腫瘤細胞核，VEGF位于細胞胞漿，顏色介于淡黃色－棕褐色，所有染色后圖片均由固定的二位病理醫師雙盲法閱片。選取細胞分布均勻區域準確計數200個細胞，統計細胞染色程度和著色細胞個數。計分規則：無色0分，淺色1分，深色2分，計算每個樣本總分數。

1.5 數據分析 利用SPSS 11.5軟件繪制受試者工作曲線（ROC曲線），計算曲線下面積，根據ROC曲線判斷最佳診斷性能（靈敏度與特異度之和最大）時候的界值，并計算陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比和尤登指數（Youden index，YI）。

2 結果

2.1 良性、惡性腹水細胞TCT制片后行SABC細胞化學染色，計算其染色得分分布 惡性腹水的VEGF、端粒酶染色結果均偏向于得分軸的右側，呈現偏態分布，以大分值為主；良性腹水細胞染色結果呈現正態分布，且其中位數明顯小于惡性腹水染色得分中位數（P＜0.01），見圖1。

圖1 良性、惡性腹水的TCT制片細胞染色得分分布

2.2 VEGF、端粒酶染色得分值 以確診實驗的結果為金標準結果，統計VEGF、端粒酶染色得分值，以此分值為診斷結果，數據輸入SPSS11.5軟件，繪制ROC曲線，見圖2。以SPSS反饋數據得出最佳陽性判斷界值為VEGF＞300分、端粒酶＞320分為陽性，計算兩者的診斷性能指標，圖2、見表1。

3 討論

惡性腹水是惡性腫瘤侵襲轉移的一種表現，很多非惡性疾病也能引起腹水，如結核病、肝硬化、低蛋白癥等。鑒別腹水的良性、惡性一直是臨床醫生困惑的問題。傳統的鑒別腹水性質的方法—靈敏度和特異度都不盡人意，雖然直接檢查腹水中的癌細胞具有診斷意義，但是其陽性率不高，容易漏診。因此，尋求一種高診斷性能的檢驗方法鑒別診斷腹水的性質顯得尤為重要。

圖2 ROC曲線

表1 根據ROC曲線計算各性能指標

VEGF是一種促內皮細胞有絲分裂原，能增加血管通透性，促進血管內皮細胞增殖，在惡性腹水的形成中，VEGF扮演著重要的角色［1］，有報道稱，卵巢癌患者腹水中的VEGF含量明顯高于良性腹水中的含量［2］，說明檢測腹水中VEGF的含量具有鑒別良性、惡性腹水的能力。端粒酶是腫瘤的一個顯著特征，其高表達見于各種惡性腫瘤，而正常組織檢測不到有活性的端粒酶。據國外報道，98%的腫瘤細胞系、90%的原發腫瘤皆表現出端粒酶活性［3］，因此，有人建議用端粒酶來作為惡性腫瘤的標志物，其診斷靈敏度和特異性甚至可以達到90%［4］。VEGF以可溶性細胞因子的形式存在，并可經分泌小泡分泌到細胞外，而端粒酶則存在于細胞核內部，其活性主要表現為對染色質端粒的編輯。

液基薄層細胞學技術是近些年的一項新技術，因其在婦科宮頸疾病診斷方面具有獨到的優點而受到國內外學者的廣泛青睞［5］。近年來有人將其應用于腹水細胞檢查，并且也得到了很高的診斷符合率，且涂片背景清晰，惡性細胞容易分辨，細胞團中單個細胞界限分明，染色清晰，極大地提高了識別的準確度［6］。

本研究收集本院確診為惡性腹水和良性腹水患者為研究對象，采取細胞內定位半定量檢測VEGF和端粒酶的表達。結果顯示，惡性腹水患者的腹水細胞VEGF和端粒酶表達明顯高于良性腹水的二者表達量（P＜0.05，結果另文發表），表達分數呈現偏態分布，分值都比較高。而良性腹水細胞表現為正態分布，但是其中位數要明顯小于惡性腹水分布的中位數（P＜0.05，結果另文發表）。

對本文收集的135例標本進行SABC細胞化學染色，并統計染色深度評分，繪制ROC曲線顯示，曲線下面積VEGF為0.953，端粒酶為0.957，表明二者具有較高的診斷價值。以ROC曲線最接近左上角點的值為最佳診斷指標判定點，其診斷敏感性VEGF為 0.900，端粒酶為 0.933，診斷特異性VEGF為0.920，端粒酶為0.933。且給出以VEGF為檢測對象的陽性臨界值為300分，端粒酶為320分。此結果表明，采取本研究方法選擇最佳的陽性臨界值，用VEGF和端粒酶表達為診斷指標鑒別診斷腹水的性質，具有很高的診斷正確度。

由此可見，作為一種輔助檢驗方法，TCT制片后用細胞免疫化學染色檢測判定腹水的良性、惡性具有較好的診斷價值。在高度懷疑惡性腹水，而細胞學檢查陰性，且其他檢查未發現病變時，可以對腹水細胞行VEGF、端粒酶免疫細胞化學染色，計算染色深淺得分，從而對腹水性質進行判斷。

［1］Neulen J，Yan Z，Raczek S，et al.Human chorionic gonadotropin dependent expression of VEGF／VPF in human granulosa cell：Importance in ovarian hyperstimulation syndrome［J］.J Clin Endocrihol Metab，1995，（80）：1967.

［2］Yamamoto S，Kanishi I，Mandai M，et al.Expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）in epithelial ovarian neoplasms：Correlation with clinicopathology and patient survival，and analysis of serum VEGF levels［J］.Br J Cancer，1997，76（9）：1221.

［3］Kim JL，Piatyxzek MA，Prowse K R，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer［J］.Science，1994，266：2011.

［4］Dahse R，Fiedler W，Ernst G.Telomeres and telomerase：biological and clinical importance［J］.Clin Chem，1997，43：708.

［5］潘秦鏡，李凌，喬友林，等.液基細胞學篩查宮頸癌的研究［J］.中華腫瘤雜志，2001，23（4）：309.

［6］施海法，血管內皮生長因子和端粒酶與惡性腹水的相關性分析［J］.疑難病雜志，2010，9（6）：448.