血管緊張素原基因M235T多態性與結直腸癌易感性關系的研究

侯 波

（吉林省人民醫院 急診外科，吉林 長春130021）

血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）作為腎素－血管緊張素系統中的第一步限速反應的底物，不僅在調節血壓和穩定體液平衡方面發揮著極為重要的作用，而且能夠抑制腫瘤細胞增殖、遷移和腫瘤血管的形成［1］。位于AGT基因第2外顯子的T→C錯義突變導致編碼產物第235號氨基酸的轉變：甲硫氨酸（Met）→蘇氨酸（Thr）。以往多項研究調查了AGT基因M235T多態性與多種腫瘤易感性的關系［2－6］。然而，其與中國人群結直腸癌的相關性尚未見報道。本研究采用病例－對照研究分析了AGT基因M235T多態性與中國人群結直腸癌的相關性，旨在尋求新的結直腸癌分子遺傳學標記物，為揭示其發病機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選自入住我院普外科結直腸癌患者151例，男性90例，女性61例，平均年齡59.7（±13.4）歲。所有病例均經組織病理學確診，其中高中分化87例，低分化64例；臨床Ⅰ－Ⅱ期86例，臨床Ⅲ－Ⅳ期65例；有遠處轉移87例，無轉移64例。對照組選自我院健康體檢中心，共202例，男性128例，女性74例，平均年齡57.3（±11.5）歲，無腫瘤家族史，各項體檢指標均正常。所有入選對象均為無血緣關系漢族個體。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物合成 采集入選對象者外周靜脈血3ml，按照北京百泰克生物科技公司全血基因組DNA提取試劑盒操作說明提取DNA。參照文獻［7］設計引物，上游引物：5’－CAGGGTGC TGTCCACACTGGACCCC－3’，下游引物：5’－CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT－3’。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增 PCR 反應體系為25μl，含10×反應緩沖液3.0μl，dNTP 2.5μl，MgCl21.5μl，上、下游引物各0.25μl，TaqDNA 聚合酶1.0U，基因組DNA 1.5μl，用無菌去離子水補足至25μl。

在PCR擴增儀（Eppendorf 5331，德國）上按以下條件進行循環反應：94℃預變性4min；94℃變性30s，67℃退火45s，72℃延伸90s，35個循環；末次循環后72℃延伸10min。

1.2.3 限制性內切酶酶切PCR擴增產物 取PCR擴增產物3μl，用限制性內切酶TthIII I（NEB公司，美國）酶切。65℃孵育4小時，反應終止后，酶切產物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，以DNA MarkerI作為標準參照物分析判讀結果。

1.3 統計學方法

直接計數法計算結直腸癌組和對照組AGT M235T基因型和等位基因頻率，Hardy－Weinberg遺傳平衡定律用于檢測基因型的遺傳平衡狀態，各組間比較采用χ2檢驗，比值比（OR）及其95%可信區間（CI）用于估計相對危險度。所有數據均運用SPSS19.0統計軟件包處理，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

PCR擴增片段大小為165bp，經限制性內切酶TthIII I酶切后呈現以下三種情況：MM基因型（165bp一條帶）；MT基因型（165bp、141bp和24 bp三條帶）；TT基因型（141bp和24bp兩條帶）。

結直腸癌組與對照組AGT M235T基因型和等位基因頻率分布見表1，兩組基因型頻率均符合Hardy－Weinberg平衡（P＞0.05），表明入選對象具有較好的群體代表性。結直腸癌組AGT M235T基因型（TT、MT和MM）和等位基因（T和M）構成比與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

根據臨床病理特征進行分層分析，發現TT基因型在高中分化和低分化結直腸癌患者中分布差異具有統計學意義（χ2＝6.95，P＝0.008），比值比（95%CI）為2.50（1.26－4.97）；未發現 AGT M235T多態性與結直腸癌臨床分期和轉移狀態之間存在明顯相關性（P＞0.05）（見表2）。

表1 結直腸癌組與對照組AGT M235T多態性分布

表2 AGT M235T多態性與結直腸癌臨床病理特征相關性

3 討論

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，盡管其發病機制尚未完全闡明，但已經證實其發生發展是多因素長期共同作用的結果，其中肥胖被認為是結直腸癌的一個重要危險因素［8］。血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）主要在肝臟合成，肝外主要來源于脂肪組織；脂肪組織中過表達AGT mRNA能夠造成血漿AGT含量明顯增高，同時造成脂肪堆積，最終引起肥胖［9］。在小鼠動物模型中，AGT基因缺陷能夠部分阻止由于飲食引起的肥胖［10］。由此推測，肥胖相關基因（AGT）與結直腸癌的發病具有一定的相關性。

本研究采用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性方法探討了中國人群AGT基因M235T多態性與結直腸癌易感性的關系，雖然未發現該多態性在病例組和對照組中存在明顯相關性，但是分層分析發現低分化結直腸癌患者中TT基因型頻率明顯高于高中分化結直腸癌患者，攜帶TT基因型個體患低分化結直腸癌的風險比攜帶MT／MM基因型高2.50倍，表明攜帶TT基因型的結直腸癌患者更容易呈現低分化狀態和更高的惡性程度。

該研究結果與文獻報道一致，Vasku等調查了捷克人群中AGT M235T多態性與結直腸癌發病風險的關系（102例結直腸患者和101例非結直腸癌個體），發現AGT M235T多態性在病例組和對照組中分布無差異，并且與臨床分期無關［6］。遺憾的是，該研究未進一步分析該多態性與結直腸癌分化狀態的相關性。關于AGT M235T多態性與其他腫瘤易感性的關系，目前，文獻報道結果并不一致。Gonzalez－Zuloeta等報道AGT M235T多態性 M等位基因增加了荷蘭絕經后婦女乳腺癌的發病風險［5］。然而，Mendizabal－Ruiz等報道AGT M235T多態性與墨西哥婦女乳腺癌的發病無關［4］。此外，有報道AGT M235T多態性與口腔癌、胃癌的發病無關［2，3］。不能排除這種差異是由于種族差異引起的，因此，有必要進行多中心、多種族、大樣本的協同研究以明確AGT M235T多態性與腫瘤的相關性。

綜上所述，本研究發現AGT M235T多態性與中國人群結直腸癌的分化程度密切相關，攜帶TT基因型的結直腸癌患者更容易呈現低分化病理狀態。更大樣本量的重復驗證性研究有望為結直腸癌的風險預測、個體化用藥和臨床有效防治提供新的線索。

［1］Bouquet C，Lamande N，Brand M，et al.Suppression of angiogenesis，tumor growth，and metastasis by adenovirus－mediated gene transfer of human angiotensinogen［J］.Mol Ther，2006，14（2）：175.

［2］Vairaktaris E，Yapijakis C，Vylliotis A，et al.，Angiotensinogen polymorphism is associated with risk for malignancy but not for oral cancer［J］.Anticancer Res，2008，28（3A）：1675.

［3］Shibata T，Tahara T，Arisawa T，et al.Polymorphism of the salt sensitivity gene angiotensinogen and gastric cancer risk［J］.Mol Med Report，2011，4（4）：723.

［4］Mendizabal－Ruiz AP，Morales J，Castro Martinez X，et al.，RAS polymorphisms in cancerous and benign breast tissue［J］.J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2011，12（2）：85.

［5］Gonzalez－Zuloeta Ladd AM，Arias Vasquez A，Siemes C，et al.Differential roles of Angiotensinogen and Angiotensin Receptor type 1polymorphisms in breast cancer risk［J］.Breast Cancer Res Treat，2007，101（3）：299.

［6］Vasku A，Vokurka J，Bienertova－Vasku J.Obesity－related genes variability in Czech patients with sporadic colorectal cancer：preliminary results［J］.Int J Colorectal Dis，2009，24（3）：289.

［7］Aggarwal PK，Jain V，Jha V.Endothelial nitric oxide synthase，angiote nsin－converting enzyme and angiotensinogen gene polymorphisms in hypertensive disorders of pregnancy［J］.Hypertens Res，2010，33（5）：473.

［8］Bray GA，Paeratakul S，Popkin BM.Dietary fat and obesity：a review of animal，clinical and epidemiological studies［J］.Physiol Behav，2004，83（4）：549.

［9］Ronti T，Lupattelli G，Mannarino E.The endocrine function of adipose tissue：an update［J］.Clin Endocrinol（Oxf），2006，64（4）：355.

［10］Massiera F，Bloch－Faure M，Ceiler D，et al.Adipose angiotensinogen is involved in adipose tissue growth and blood pressure regulation［J］.FASEB J，2001，15（14）：2727.