葉酸－聚天門(mén)冬氨酸－超小超順磁性氧化鐵的制備及MR成像研究

張卜天，劉 亮，宋 涵，苗瑩瑩，張惠茅

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 放射線科，吉林 長(zhǎng)春130033）

研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體在乳腺癌腫瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)，有時(shí)是正常組織的20－300倍，并且葉酸受體表達(dá)的程度與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)［1］，因此針對(duì)葉酸的靶向成像能夠可以達(dá)到早期診斷的目的，并能評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后。USPIO是一種能夠被單核網(wǎng)狀細(xì)胞系統(tǒng)攝取的造影劑，與Gd劑相比，其具備更好的靈敏度與特異度［2］。目前很多研究合成了以USPIO為基礎(chǔ)的葉酸靶向造影劑，然而，受限于復(fù)雜的制備和純化方法，目前這些造影劑還不能滿足臨床需求［3，4］。因此，本研究將探討葉酸介導(dǎo)的耦聯(lián)天門(mén)冬氨酸（PASP）的 USPIO（FA－PASPUSPIO）的合成方案對(duì)于乳腺癌細(xì)胞MR成像的可行性。

1 材料與方法

1.1 對(duì)比劑

1.1.1 水相共沉淀法制備 USPIO：將含有5.6 mmol／L FeCl3和11.2mmol／L FeCl2的150ml水溶液通N2氣除氧，加熱至50℃，在500r／min下攪拌，在通 N2氣條件下迅速加入12.5ml NH3·H2O，于50℃ 水浴中反應(yīng)30min.反應(yīng)后通過(guò)磁鐵將沉淀物與溶液分離，傾去上清液，用已通氮除氧的高純水洗滌3次后，重新分散在20ml純水中。加入不同量的 PASP，用0.1mol／L HCl將溶液pH調(diào)至3.5后，將溶液置于50℃水浴中反應(yīng)1h，即得到PASP修飾的 USPIO［5］。

1.1.2 folate修飾 USPIO磁性納米粒子：配置0.02M天冬氨酸溶液，調(diào)Fe3O4溶液pH 值至3.50，然后將天冬氨酸溶液與之混合置50℃水浴反應(yīng)1小時(shí)。配置0.02Mfolate溶液，與上述溶液混合攪拌，在50℃水浴繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。調(diào)控加入天冬氨酸和folate的比例來(lái)控制最后得到的磁性粒子的表面性質(zhì)。

通過(guò)傅里葉紅外光譜（FTIR）對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析：取樣品0.5mg，干燥晶體50mg于瑪瑙研缽中充分研磨至粉末極細(xì)（粒徑＜2μm），進(jìn)行壓片操作，壓出的片盡量滿足半透明，厚度均一。放入樣品池進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。TEM 透射電鏡測(cè)試：取數(shù)小滴液體樣品于潔凈的玻璃片上，將包裹碳膜的銅網(wǎng)小心蓋在液滴上，10min后吸去銅網(wǎng)上液滴，將銅網(wǎng)裝入樣品桿，放入TEM主機(jī)進(jìn)行測(cè)試。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)的EMT－6細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，平均每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)（5×105個(gè)），分3組細(xì)胞，24 h后分別添加FA－PASP－USPIO、USPIO、FA＋FAPASP－USPIO各100μmol Fe／L（競(jìng)爭(zhēng)抑制組提前30min加入100μmol／L葉酸孵育），孵育2h。PBS沖洗3次，以0.25%胰蛋白酶消化至9個(gè)1.8mlEP管內(nèi)，10 000rot／min，離心3min，吸去管內(nèi)液體，每管加1ml熱瓊脂糖（1%瓊脂糖）吹散。采用Philips 3.0T磁共振進(jìn)行掃描，采集T2WI，TR＝4 000ms，T2＝100ms，F(xiàn)OV85mm×85mm，層 厚2mm，層間 距1mm。測(cè)定腫瘤T2值并計(jì)算腫瘤感興趣區(qū)的SNR的變化率。

1.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)用動(dòng)物模型訂購(gòu)于上海市腫瘤研究所。動(dòng)物模型制備過(guò)程如下：在無(wú)菌條件下，將0.1毫升EMT－6細(xì)胞懸液（約1×105）注射入BALB／C（5－6周齡，約15－20克）左腋下皮下，經(jīng)無(wú)葉酸飲食6天后瘤徑達(dá)到1.0cm用于動(dòng)物成像實(shí)驗(yàn)［6］。

1.4 掃描方案

Philips 3.0T超導(dǎo)型磁共振掃描儀，包括冠狀位、軸位快速自旋回波FSE T2WI序列，T1WI序列。俯臥位，頭先進(jìn)，小動(dòng)物專用線圈。掃描范圍覆蓋裸鼠全身各臟器。

FSET2WI成像參數(shù)：重復(fù)時(shí)間（TR）1sooms，回波時(shí)間（TE）84.9ms，層厚2mm，層間距1.2 mm，激勵(lì)次數(shù)（NEX）10，矩陣192×160，視野（FOV）6cm×6cm。

T1WI成像參數(shù)：TR300ms，TE12.0ms，層厚2 mm，層間距0.2mm，NEX 2，矩陣256×192，F(xiàn)OV 6cm×6cm。

取荷瘤小鼠20只，分為兩組，用0.4%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射進(jìn)行麻醉，麻醉劑量約為0.15－0.20ml（小鼠體重25－30克）。采用上述序列進(jìn)行平掃后，每組經(jīng)鼠尾靜脈分別注入U(xiǎn)SPIO及FAPASP－USPIO。USPIO組注射濃度1mg Fe／ml，注射劑量100μlFA－PASP－USPIO組注射濃度為1mg Fe／ml，注射劑量100μl。分別于注射后即刻，10min，1h采用上述序列掃描。

1.5 數(shù)據(jù)分析

體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 測(cè)定腫瘤、背景噪聲感興趣區(qū)ROI的信號(hào)強(qiáng)度（SI），ROI面積約為5mm2。SNR＝SI組織／SI背景。采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析Mauchly’s test對(duì) USPIO 組與 FA－PASP－USPIO組注藥前，注藥后即刻、30min、1h腫瘤實(shí)質(zhì)的SNR進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

病理分析 注射造影劑行磁共振掃描，24h后，處死小鼠，迅速取出小鼠瘤體，用4%多聚甲醛溶液浸泡24小時(shí)。石蠟包埋，行HE染色。使用顯微鏡觀察腫瘤組織的細(xì)胞分布特點(diǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從外觀看，F(xiàn)A－PASP－USPIO水溶液呈棕黃色，透明，無(wú)團(tuán)聚。TEM 電鏡顯示FA－PASP－USPIO外形基本規(guī)則，平均粒徑約為10.9nm（圖1）。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FA－PASP－USPIO組與USPIO組和FA＋FA－PASP－USPIO組比較，其SNR變化率明顯改變（P＜0.05），而 USPIO組和FA＋FA－PASPUSPIO組比較，SNR變化率值不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.18）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明USPIO組注藥即刻掃描腫瘤SNR下降具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），30 min、1h時(shí)SNR與注藥前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而FAPASP－USPIO組腫瘤信號(hào)30分鐘、1h與注藥前比較均明顯下降（表1）。HE染色觀察，癌細(xì)胞成條索狀排列，間質(zhì)成分較少，其內(nèi)可見(jiàn)壞死灶（圖2）。

圖1 TEM電鏡結(jié)果

圖2 光鏡下腫瘤的病理結(jié)果

表1 注藥前后SNR變化率（%）

3 討論

乳腺癌的發(fā)病與葉酸缺乏或代謝障礙密切相關(guān)，葉酸在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甲基化反應(yīng)和保持基因組穩(wěn)定性方面具有重要作用［7］，而葉酸受體（FR）在乳腺癌細(xì)胞中呈超表達(dá)，且表達(dá)程度與預(yù)后相關(guān)［8－10］。因此，對(duì)葉酸受體進(jìn)行無(wú)創(chuàng)成像可以早期診斷乳腺癌，并評(píng)估葉酸受體與腫瘤惡性程度及預(yù)后的具體關(guān)系。作為一種非侵入性的成像手段，MR分子影像在腫瘤的早期檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。目前，有研究利用Gd－DTPA偶聯(lián)葉酸制備了針對(duì)葉酸受體的T1陽(yáng)性靶向造影劑［2，11］，但由于制備復(fù)雜，純化困難，而且血漿半衰期短、圖像對(duì)比度低。因此，Meier等人［12］。通過(guò)酰胺鍵使 USPIO偶聯(lián)葉酸制備了T2陰性靶向造影劑，其解決了T1陽(yáng)性靶向造影劑半衰期短，對(duì)比效果差的缺點(diǎn)，但仍存在制備復(fù)雜的問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)采用成熟的水浴共沉淀法制備的FAPASP－USPIO水溶液外觀呈棕黃色，液體透明清亮，無(wú)團(tuán)聚；TEM測(cè)得葉酸包被后粒徑約10.9nm，分散性較好，滿足MR成像所要求的粒徑范圍（2－20nm），易被細(xì)胞吞噬、降解；采用PASP包被USPIO粒子，外層與葉酸耦聯(lián)構(gòu)成靶向顯影探針。與chen和choi等人報(bào)道的合成方法比較［3，4］，本研究設(shè)計(jì)的合成方案因采用聚天冬氨酸（PASP）作為表面修飾劑，使靶向造影劑粒徑更小，而且通過(guò)調(diào)節(jié)PASP的量可以有效調(diào)節(jié)膠體的穩(wěn)定性，從而使規(guī)模化合成更加簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的純化或透析。

體外MR成像顯示，靶向組T2信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，SNR變化率與競(jìng)爭(zhēng)抑制組、對(duì)照組比較具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明 FA－PASP－USPIO 對(duì)于 EMT－6細(xì)胞具備靶向作用，即能特異性識(shí)別葉酸受體，針對(duì)葉酸受體進(jìn)行靶向成像。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FA－PASP－USPIO對(duì)EMT－6細(xì)胞具備48%的增強(qiáng)效果，CHEN等人報(bào)告其合成的葉酸介導(dǎo)的USPIO在 KB細(xì)胞成像中的增強(qiáng)效果為 20%－25%［6］，CHOI等人報(bào)告其制備的葉酸偶聯(lián)USPIO在KB細(xì)胞中的增強(qiáng)效果為38%［4］。這些差異是由多種因素導(dǎo)致的，比如納米顆粒的大小，每個(gè)納米顆粒所攜帶的葉酸配基的數(shù)量，造影劑的濃度，脈沖序列的參數(shù)，注射造影劑后的掃描時(shí)間等，這需要進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，USPIO與FA－PASP－USPIO在注藥后即刻掃描，腫瘤部位都出現(xiàn)強(qiáng)化表現(xiàn)。這與已報(bào)道的結(jié)果相一致［13－15］。這表明在注射后兩種造影劑都存在非特異性灌注效果，這與腫瘤間質(zhì)中富含新生血管有關(guān)（如圖）。在注藥后1h掃描發(fā)現(xiàn)，USPIO組SNR與注藥前比較輕度下降，而FAPASP－USPIO組SNR明顯下降，二組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。USPIO組SNR下降或許與腫瘤細(xì)胞表面空隙增大，細(xì)胞間隙增寬有關(guān)［16］，這種結(jié)構(gòu)導(dǎo)致USPIO逐漸滲入至細(xì)胞內(nèi)，從而出現(xiàn)輕微的延遲強(qiáng)化。而FA－PASP－USPIO組SNR明顯下降，表明FA－PASP－USPIO利用FR對(duì)葉酸的高親和力，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞方式使造影劑高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，同時(shí)FR的再循環(huán)使以葉酸為探針的USPIO在靶細(xì)胞內(nèi)不斷聚集，進(jìn)而增強(qiáng)顯影效果，證明FA－PASP－USPIO對(duì)葉酸表達(dá)陽(yáng)性的EMT－6細(xì)胞具備明顯的靶向增強(qiáng)作用，并且由于EMT－6細(xì)胞特異性攝取造影劑，腫瘤的實(shí)質(zhì)和間質(zhì)得以在MRI圖像上進(jìn)行區(qū)分。

我們的實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足，在體外實(shí)驗(yàn)只對(duì)EMT－6一種乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)估，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)需要對(duì)多種乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，期望能夠獲得和EMT－6細(xì)胞中一樣的靶向增強(qiáng)效果。而且，本次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有針對(duì)不同惡性程度的乳腺癌進(jìn)行體內(nèi)成像，沒(méi)能進(jìn)一步評(píng)估葉酸受體表達(dá)量與腫瘤惡性程度的具體關(guān)系，這尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，利用葉酸的生物安全性及葉酸與FR的高度特異性結(jié)合性質(zhì)所制備的FA－PASP－USPIO對(duì)EMT－6細(xì)胞具有較好的靶向效應(yīng)，具備成為一種有效的靶向顯影劑的潛力。

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