不同劑量卡維地洛對急性心肌梗死后心衰大鼠膠原合成的影響

安 喆，楊春艷，楊紅亮，葛麗麗，高天紅，張文琪

（吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033）

心肌梗死后心室重塑是一種進行性發(fā)展的病理生理過程，是心臟對射血分數降低所致的血流動力學改變的一種代償反應，主要是非梗死區(qū)的心肌細胞、成纖維細胞增生肥大及基質膠原網絡的代謝異常，它貫穿于MI后的心室肥大和心力衰竭的發(fā)展過程中［1－2］。 轉化生長因子－β1 （transforming growth factor－β1，TGF－β1）是一種局部產生的與各種組織器官纖維化有關的細胞因子，其通過旁分泌或自分泌的方式可以刺激成纖維細胞的增生、細胞外基質的沉積而參與心室重塑。

有證據顯示，在心力衰竭的過程中（包括代償期和失代償期）心源性腎上腺素系統(tǒng)參與了心功能的代償和最終導致的損傷過程。人類心肌細胞主要有三種腎上腺素能受體：β1、β2和α1受體，各自具有不同的生理和病理功能。大量循證醫(yī)學證據顯示，卡維地洛可以以時間依賴性方式逆轉原發(fā)性或繼發(fā)性心肌重塑［2－6］。可以降低心力衰竭患者的病死率、再住院率和改善生活質量，但其作用的細胞及分子機制尚未完全闡明。

本研究擬通過建立實驗性大鼠急性心肌梗死后心衰模型，從分子水平探討TGF－β1和Ⅰ型膠原在心肌梗死后心室重塑中的作用及二者關系，探討卡維地洛對AMI后大鼠心肌重構中心肌纖維化的影響。

1 材料和方法

1.1 動物及處理

雌性Wistar大鼠40只，體重200－220g，合格證號：SCXK2（吉）200320001，由吉林大學實驗動物中心提供。大鼠隨機分為手術組（30只）及假手術組（10只），乙醚吸入麻醉后，手術組參照文獻［3］方法結扎大鼠左冠脈，假手術組僅穿線不結扎冠脈。冠脈結扎術后72小時死亡5只大鼠，1周內死亡1只大鼠。手術組從術后第2周至實驗結束無大鼠死亡。假手術組2只大鼠死于麻醉意外。

1.2 藥物及試劑

卡維地洛由北京巨能制藥有限責任公司提供，批號：991001。RT－PCR （reverse transcription－polymerase chain reaction）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

分組及給藥 6周后，將存活的32只 Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、模型＋小劑量卡維地洛組、模型＋大劑量卡維地洛組，每組8只。模型＋小劑量卡維地洛組給予卡維地洛1mg／kg／d灌胃，模型＋大劑量卡維地洛組給予卡維地洛10mg／kg／d灌胃，假手術組及模型組灌胃給予0.5%CMC。各組分別于術后第7周開始給藥，連續(xù)給藥5周，每日1次，灌胃容積均為10ml／kg。

1.3 梗死區(qū)及非梗死區(qū)心肌組織中膠原－I mRNA的檢測

用Trizol試劑處理梗死區(qū)心肌組織提取總RNA。使用逆轉錄酶將3μg總RNA合成雙鏈DNA（complementary DNA，CDNA）。膠原－I（collagen－I），β－actin通過 GenBank獲得（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov），并設計引物。膠原－I的上游引物5’－AGG GTC ATC GTG GCT TCT C－3’，下游引物5’－ACC TTC GCT TCC ATA CTC G－3’。βactin上游引物5’—GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC－3’，下游引物5’－CAA ACA TGA TCT GGG TCATCT TCT C－3’。取3μl逆轉錄產物分別應用上述蛋白的上下游引物進行PCR擴增。反應參數為：94℃預變性5分鐘，95℃變性40秒，54℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)30次，最后72℃延伸10分鐘。取10μlPCR反應產物進行1.5%瓊脂糖電泳，光密度掃描后圖片經Image J軟件分析，結果以檢測蛋白／β－actin的積分光密度比值表示。

1.4 梗死區(qū)心肌組織中TGF－β1mRNA的檢測

用Trizol試劑處理非梗死區(qū)心肌組織提取總RNA。使用逆轉錄酶將3μg總RNA合成雙鏈DNA（complementary DNA，CDNA）。TGF－β1、βactin基因序列通過 GenBank獲得（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov），并設計引物。TGF－β1的上游引物5’－CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C－3’，下游引物5’－CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C －3’。β－actin 上游引物5’—GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC－3’，下游引物5’－CAA ACA TGA TCT GGG TCATCT TCT C－3’。取3μl逆轉錄產物分別應用上述蛋白的上下游引物進行PCR擴增。反應參數為：94℃預變性5分鐘，95℃變性40秒，54℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)30次，最后72℃延伸10分鐘。取10μl PCR反應產物進行1.5% 瓊脂糖電泳，光密度掃描后圖片經Image J軟件分析，結果以檢測蛋白／β－actin的積分光密度比值表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

計量資料以均數±標準差（±s）表示，用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組數據間比較采用t檢驗，多組間的相關性比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 梗死區(qū)心肌組織的膠原－I mRNA的表達

與假手術組比較，急性心肌梗死大鼠的梗死區(qū)心肌組織中膠原－I mRNA的表達上調（P＜0.001）。與心梗對照組比較，小劑量卡維地洛組表達下調（P＜0.001），大劑量卡維地洛組表達亦下調（P＜0.001）。但小劑量卡維地洛組組與大劑量卡維地洛組組表達水平接近，兩組間差異無顯著性（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 各組梗死區(qū)心肌組織collagen I mRNA的表達

2.2 非梗死區(qū)心肌組織的膠原－I mRNA的表達

與假手術組比較，急性心肌梗死大鼠的非梗死區(qū)心肌組織中膠原－I mRNA的表達上調（P＜0.01）。與心梗對照組比較，小劑量卡維地洛組表達下調（P＜0.05），大劑量卡維地洛組組表達亦下調（P＜0.05）。其中，小劑量卡維地洛組與大劑量卡維地洛組表達水平接近，兩組間差異無顯著性（P＞0.05）（見圖2）。

2.3 心臟梗死區(qū)心肌的TGF－β1mRNA的表達

與假手術組比較，心梗大鼠的梗死區(qū)心肌組織中TGF－β1mRNA的表達上調（P＜0.001）。與心梗對照組比較，小劑量卡維地洛組TGF－β1mRNA表達下調（P＜0.01），大劑量卡維地洛組 TGF－β1 mRNA的水平與小劑量卡維地洛組接近，兩組差異沒有顯著性（P＞0.05）（見圖3）。

3 討論

圖2 各組非梗死區(qū)心肌組織collagen I mRNA的表達

圖3 各組梗死區(qū)心肌組織TGF－β1mRNA的表達

心肌梗死后心室重塑是一種進行性發(fā)展的病理生理過程，是心臟對射血分數降低所致的血流動力學改變的一種代償反應。由于梗死區(qū)的心肌變薄、拉長，心肌細胞的喪失和心臟間質膠原的沉積及瘢痕的形成、替代；非梗死區(qū)的心肌細胞肥大和成纖維細胞增生及間質膠原的增生、纖維化，導致心室壁增厚、擴張、變形，收縮和舒張功能減退，最終發(fā)展為心力衰竭。TGF－β1導致心肌細胞肥厚，纖維細胞增生和間質纖維化等特征性的改變。同時，TGF－β1激活一種特殊的心肌成纖維細胞－肌樣成纖維細胞，這些肌樣成纖維細胞能夠表達α平滑肌肌動蛋白，具有平滑肌細胞的特性，并能夠合成細胞間基質，參與基質的重構。因此，積極有效的防治心室重構是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病研究領域中的熱點和難點。

心肌間質主要成分是心肌膠原［5］，膠原是ECM的最豐富成分，主要是Ⅰ型膠原（占80%－85%）和Ⅲ型膠原（占10%以上），心肌膠原與心肌細胞共同維持心臟結構和功能，心肌膠原Ⅰ、Ⅲ型的變化可以反映心肌組織的重塑。心肌梗死后膠原的過度積累則導致心肌僵硬度增加，順應性降低，AMI后的心室重構從細胞水平上包括心肌細胞重構和心肌間質重構。心肌間質主要成分是心肌膠原，為Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅰ型膠原占80%－85%。心肌梗死后非梗死區(qū)間質膠原過度沉積，增加心肌的僵硬度，加重心臟重塑進展，是損害心臟收縮和舒張功能并導致慢性心力衰竭主要因素。目前，關于β受體阻滯劑對梗死后心肌Ⅰ膠原影響的研究報道較少。本研究表明，大鼠心肌梗死心衰模型建立后，梗死區(qū)及非梗死區(qū)膠原沉積均不同程度增加。卡維地洛都可減少非梗死區(qū)，尤其是右心室的總膠原及Ⅰ型膠原的含量，進而減少心肌的僵硬度，抑制梗死后心肌重構，進一步地改善心功能尤其是舒張功能，其主要機制為抑制心源性腎上腺素系統(tǒng)參與的心功能的代償和最終導致的損傷過程。

TGF－β有5種亞型β1－β5，哺乳動物為β1，β2，β3種亞型，TGF－β1在體細胞中所占比例最高、活性最強其對膠原的合成和降解均具有調節(jié)作用，可刺激心臟成纖維細胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的表達，也可調節(jié)其膠原酶活性，減少膠原降解［7－9］。本研究表明，與假手術組比較，心梗大鼠的梗死區(qū)心肌組織中TGF－β1mRNA的表達上調。與心梗對照組比較，應用卡維地洛的兩組TGF－β1mRNA表達下調（P＜0.01），大劑量卡維地洛組 TGF－β1mRNA 的水平與小劑量卡維地洛組接近，且兩組差異沒有顯著性（P﹥0.05）。綜合上述結果，考慮卡維地洛能改善心肌梗死后大鼠細胞外基質重塑的過程，其機制可能為通過抑制TGF－β1的表達而抑制梗死區(qū)膠原分子的合成，同時減少非梗死區(qū)膠原分子的合成，從而有效地延緩整個心肌纖維化的進程，進而到達逆轉心室重構的作用，但這種作用沒有表現(xiàn)出依賴關系。

［1］McCormick RJ，Musch TI，Bergman BC，et al.Regional differences in LV collagen accumulation and mature cross－linking after myocardial infarction in rats.Am J Physiol，1994，266：H354.

［2］Lowes BD，Gilbert EM，Abraham WT，et al.Myocardial gene expression in dilated cardiomyopathy treated with beta－blocking agents［J］.N Engl J Med，2002，3 346：1357.

［3］Abraham WT，Gilbert EM，Lowes BD，et al.Coordinate changes in myosin heavy chain isoform gene expression are selectively associated with alterations in dilated cardiomypathy phenotype［J］.Mol Med，2002，8：750.

［4］El－Kady T，El－Sabban K，Gabaly M，et al.Effects of Carvedilol on myocardial perfusion and the comtractile response of chronically dysfunctional myocardium in ischemic cardiomyopathy：a 24－month study［J］.Am J Cardiovasc Drugs，2005，5：271.

［5］Pelouch V，Dixon IMC，Golfman L，et al.Role of extracellular matrix proteins in heart function.Mol Cell Biochem 1993；129：101－102.

［6］Lopaschuk GD，Kozak R.Carvedilol inhibit s fatty acid oxidation in the heart［J］.J Mol Cell Cardiol，1998，30：A112.

［7］Mody FV，Singh BN，Mohiuddin IH，et al.Carvedilol in duced enhancement of myocardial glucose utilization in normal and ischemic myocardial tissue：an evalustion by position emission tomography［J］.Am J Cardiol，1998，82：42.

［8］Vasiuk YA，Shkol＇nik EL，Kudriakov ON，et al.Effect of therapy with Carvedilol modified release on quality of life of patients with stable effort angina survivors after acute myocardial infarction.Results of PRIMA study［J］.Kardiologiia，2010，50（4）：45.

［9］Williams FM，Tanda K，Kus M，et al.Trimetazidine inhibits neutrophilnb accumulation after myocadial ischemia and reperfusion in rabbits［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1993，22（6）：828.