抑制性O(shè)DN對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜單個(gè)核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

孫 鵬，周曉晶，劉伯巖，楊文穎＊

（1.吉林省人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130117）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種以結(jié)直腸黏膜慢性感染導(dǎo)致潰瘍?yōu)樘卣鞯穆匝装Y。盡管對(duì)該疾病的發(fā)病機(jī)制研究了很多年，但是至今仍不清楚。目前潰瘍性結(jié)腸炎的治療以SASP和糖皮質(zhì)激素為主，但其療效欠佳且副作用大。因此急待開(kāi)發(fā)一種新的藥物來(lái)治療潰瘍性結(jié)腸炎。據(jù)報(bào)道，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與結(jié)腸黏膜細(xì)胞表達(dá)TLR9密切相關(guān)［1］，當(dāng)TLR9與細(xì)菌的CpG ODN結(jié)合后會(huì)激活NF－κB途徑進(jìn)而促進(jìn)免疫細(xì)胞和腸黏膜細(xì)胞分泌與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL－8，TNF－α等［2］。因此抑制TLR9與細(xì)菌CpG ODN的結(jié)合或許是治療潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)新靶點(diǎn)。抑制性O(shè)DN是TLR9的抑制劑，目前已發(fā)現(xiàn)其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、膿毒血癥等一些TLR9過(guò)度表達(dá)的自身免疫性疾病的治療研究中顯示了巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?，4］。但用ODN來(lái)抑制潰瘍性結(jié)腸炎的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究將探討抑制性O(shè)DN對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 ODNs 純化的單鏈寡聚脫氧核苷酸購(gòu)自日本Takara大連分公司（OPC級(jí)，純度90%，HPLC級(jí)，純度99%）。本研究使用的ODNs序列如下：2216 （5′－GGGGGACGATCGTCGGGGGG－3′），A151 （5′－TTAGGGTTAGGGTTAGGGT－TAGGG－3′）。所有的CpG ODNs被溶于無(wú)菌PBS中，紫外分光光度計(jì)定量，檢測(cè)內(nèi)毒素＜0.03EU／mg，符合實(shí)驗(yàn)要求，于－20℃冷藏備用。

1.1.2 本研究納入在吉林省人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心經(jīng)腸鏡檢查的10例潰瘍性結(jié)腸炎患者。每例患者各取5塊活檢組織，立即浸泡于D－Hanks緩沖液中待用。

1.1.3 人 TNF－α、IL－8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司。Trizol RNasin購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。PCR引物由上海生工合成。oligo dT購(gòu)自上海生工。AMV及AMV Buffer購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞株（LPMC）的分離 分離方法如文獻(xiàn)所述［5－6］。用10mM／L DTT溶液作用于活檢標(biāo)本30min，然后用10mM／L的EDAT溶液作用30分鐘以去除上皮，此步驟重復(fù)2－4次至溶液中觀察不到上皮細(xì)胞。然后用10ml消 化 酶 （0.02% 酶，0.01%DNase，25Mm／L HEPES）于37℃水浴，5h后用濾網(wǎng)過(guò)濾，收集溶液，12 000rpm離心5min，去上清，用 D－Hanks液重新浸泡，用巴氏管在其底部緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液。密度梯度離心，28 000rpm離心30min，巴氏管小心吸取出分層處細(xì)胞約1－2ml，將其離心，12 000rpm離心5min，棄上清。用1mL 1640溶解細(xì)胞，混勻后臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)待用。

1.2.2 培養(yǎng)LPMCs及A151干預(yù) 將分離得到的LPMCs培養(yǎng)于1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。3h后，接種于24孔培養(yǎng)板上，每孔1mL（細(xì)胞濃度：1×106／mL）。進(jìn)行如下培養(yǎng)：medium組（無(wú)干預(yù)，無(wú)2216刺激）；2216組（無(wú)干預(yù)，6μg／mL 2216刺激）；medium＋PBS組（以PBS干預(yù)，無(wú)2216刺激）；2216＋PBS組（以PBS干預(yù)，有2216刺激）；medium＋A151組（以A151干預(yù)，無(wú)2216刺激）；2216＋A151組（以A151干預(yù)，有2216刺激）；medium＋DEX組（以DEX干預(yù)，無(wú)2216刺激）；2216＋DEX組（以DEX干預(yù)，有2216刺激）。每組設(shè)三復(fù)孔，培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞及上清液，－70℃凍存?zhèn)溆?。上清液用于ELISA檢測(cè)，凡是有2216刺激的細(xì)胞用于RT－PCR檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子水平檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)應(yīng)用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL－8和 TNF－α的水平。

1.2.4 細(xì)胞中IL－8和 TNF－αmRNA 表達(dá)的檢測(cè) 參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取LPMC的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)IL－8和TNF－α基因mRNA的表達(dá)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，采用方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 A151對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者LPMCs分泌TNF－α和IL－8的影響

分離患者的 LPMCs，將其與 medium、2216（1 μg／ml）共同孵育，并用A151和DEX加以干預(yù)。48 h后，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL－8和TNF－α的表達(dá)情況。結(jié)果如表1所示，與medium相比，2216能明顯地刺激LPMCs分泌IL－8和TNF－α（P＜0.05）（圖1）。而用A151和DEX加以干預(yù)后，與PBS組相比，兩者均能抑制IL－8和TNF－α的分泌（P＜0.05），但是A151的抑制作用明顯強(qiáng)于DEX（P＜0.05）（圖1）。

表1 A151對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者LPMCs分泌TNF－α和IL－8的影響

2.2 A151對(duì)TNF－αmRNA及IL－8mRNA表達(dá)的影響

分離患者的LPMCs，將其與 medium、2216（1 μg／ml）共同孵育，并用A151和DEX加以干預(yù)。48 h后，收集LPMCs。提取LPMCs的RNA，分別以TNF－α和IL－8的引物進(jìn)行 RT－PCR反應(yīng)，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，DEX和A151均能抑制TNF－α和IL－8的mRNA的表達(dá)，但A151的抑制作用更強(qiáng)。

圖1 A151對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎患者LPMCs分泌TNF－α和IL－8的抑制作用

圖2 A151對(duì)TNF－α和IL－8的mRNA表達(dá)的抑制作用

3 討論

根據(jù)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)理－炎性細(xì)胞因子尤其是 TNF－α、IL－1β和IL－8的高表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生高度相關(guān)［7－8］，而且有研究表明正常人的腸黏膜單個(gè)核細(xì)胞與潰瘍性結(jié)腸炎病人的腸黏膜單核細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到TLR9的表達(dá)［9］，TLR9是多表達(dá)于免疫細(xì)胞內(nèi)的Toll樣受體家族的成員之一，其配體為細(xì)菌DNA或含CpG的寡聚脫氧核苷酸［2］。一旦TLR9與其配體相結(jié)合，可經(jīng) NF－κB途徑刺激細(xì)胞因子的分泌。潰瘍性結(jié)腸炎病人腸黏膜細(xì)胞可表達(dá)TLR9，而且疾病的發(fā)生與細(xì)胞因子有關(guān)，這說(shuō)明潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生或許是TLR9被激活，進(jìn)而導(dǎo)致炎性因子的分泌，從而誘發(fā)了腸黏膜的炎癥［10］。因此抑制TLR9的活化，拮抗其配體與其結(jié)合或許是治療該疾病的一個(gè)新途徑。因此，本研究利用抑制性O(shè)DN是TLR9的抑制劑這一特點(diǎn)，探索其是否具有治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制性O(shè)DN能夠抑制潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF－α及IL－8，而且能抑制這兩種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。因此本研究為研發(fā)新的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物提供了思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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