載藥納米炭的淋巴化療對小鼠結腸癌轉移模型腫瘤細胞凋亡的影響

呂國慶，閆 晶，李 冠，裴大兵，何立銳，李 亮，肖 平

（北京大學深圳醫院1.胃腸外科；2.手術室，廣東 深圳518036）

結腸癌的常規化療途徑是將抗癌藥通過靜脈等血液途徑注入體內，全身的不良反應較重，而且藥物難以進入淋巴系統。若在術前將抗癌藥物導入淋巴系統內，殺滅或減低腫瘤細胞的活性，將有助于預防復發和轉移。本研究應用載藥納米碳靶向性進入淋巴系統，對小鼠結腸癌轉移模型進行淋巴化療，探討其對腫瘤細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠結腸癌淋巴結轉移模型的建立

將小鼠結腸低分化腺癌Colon 26細胞株（南方醫科大學鐘田雨博士提供），經細胞復蘇、換液、傳代等操作，制成2.5×106／ml的單細胞懸液，取雄性清潔級Balb／C小鼠（購于廣東省醫學實驗動物中心），4－6周齡，體重18－20g，SPF（Specefic pathogen free無特定病原體級實驗動物）級條件下分籠飼養。在每只小鼠左側后肢爪墊無菌消毒后皮下接種0.04 ml（約1.0×105個）細胞懸液，接種10－12天后注射處有腫瘤開始生長，爪墊成瘤25－30天后腘窩淋巴結內有腫瘤細胞轉移。

1.2 藥物制備、實驗分組及給藥方案

藥物配制：①納米炭作為載體吸附氟尿嘧啶：1 ml納米炭（CNP，又名卡納林，lmlCNP含納米炭50 mg，重慶萊美藥業有限公司生產）與3ml氟尿嘧啶（5－Fu）注射液（1ml 5－FU 溶液含5－FU 25mg，上海旭東海普藥業有限公司生產）混合，用振蕩器振蕩15分鐘，制成混合液備用。②納米炭作為載體吸附奧沙利鉑：1ml納米炭混懸液與取奧沙利鉑注射液3ml（1ml注射液含奧沙利鉑2mg，深圳海王藥業有限公司生產）混合，用振蕩器振蕩15分鐘，制成混合液備用。

在接種腫瘤細胞懸液的第36天，將符合實驗條件的40只小鼠隨機分成4組，每組10只。藥物注射部位均在小鼠左后肢爪墊腫瘤生長處皮下，共注射4點，連續給藥2天，每天1次。A組注射0.1ml 5%葡萄糖溶液；B組注射0.1ml納米炭氟尿嘧啶混合液；C組注射0.1ml納米炭奧沙利鉑混合液；D組注射0.05ml納米炭奧沙利鉑混合液和0.05ml納米炭氟尿嘧啶的混合液，每種藥物各注射2點。

1.3 TUNEL法檢測腘窩淋巴結轉移癌細胞凋亡指數；流式細胞儀檢測爪墊腫瘤細胞凋亡率

1.3.1 在注射藥物結束48h后，拉頸髓法處死全部小鼠。摘取其左后肢腘窩淋巴結，經福爾馬林液固定、常規制作的4μm厚度石蠟切片。TUNEL凋亡試劑盒（美國羅氏公司）檢測腘窩淋巴結細胞凋亡指數，凋亡細胞呈棕褐色。每張切片選取10個高倍鏡視野（400×），計數凋亡細胞占總數的百分比，細胞總數不少于1000個。計算凋亡指數（ApoptosisIndex，AI）。AI＝凋亡細胞數／細胞總數×100。

1.3.2 取爪墊腫瘤組織，用無菌手術刀片將腫瘤組織切成1cm3左右的小塊，以0.25%EDTA－胰蛋白酶消化，經400目篩網濾過，制成單細胞懸液，1 000 rpm／min離心5min。沉淀細胞用孵育緩沖液重懸，Annexin V－FITC和PI避光染色，采用美國Beckman Coulter公司Elite流式細胞儀檢測癌細胞的凋亡率。

1.4 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件處理實驗數據，采用單因素方差分析和LSD法進行各組之間的兩兩比較，計量資料數據用平均數±標準差（±s）表示，P＜0.05認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 40只符合實驗條件小鼠，爪墊腫瘤生長良好，第36天時種植腫瘤直徑平均為10－12mm，左側后肢腘窩區可捫及較明顯腫大淋巴結。注藥后各組小鼠無死亡，爪墊注藥部位無潰瘍及壞死。與A組相比，B組、C組、D組小鼠腘窩淋巴結黑染。

2.2 TUNEL法檢測小鼠腘窩淋巴結腫瘤細胞凋亡指數結果

A、B、C及D組淋巴結腫瘤細胞凋亡指數分別為（0.915±0.263）%，（8.80±0.864）%，（8.78±0.916）%，（10.75±0.85）%，B、C和D組分別與A組相比有顯著性差異（P＜0.05），D組分別與B組、C組相比差異顯著（P＜0.05）。B組、C組比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

表1 TUNEL法檢測小鼠腘窩淋巴結轉移癌細胞凋亡指數（%）

2.3 流式細胞儀檢測爪墊腫瘤細胞凋亡率結果

A、B、C及D組爪墊腫瘤細胞凋亡率分別為（1.330±0.347）%，（17.360±2.894）%，（17.950±2.234）%，（24.220±3.216）%，B組、C組和D組分別與A組相比，差異顯著（P＜0.05）；D組分別與B組、C組相比差異顯著（P＜0.05）。C組、D組小鼠爪墊腫瘤細胞凋亡率差異不顯著（P＞0.05）。見表2。

3 討論

結腸癌最常見的轉移途徑是通過淋巴系統，目前針對轉移淋巴結主要采用手術清掃的方法，但極易遺漏微小的轉移淋巴結，可能導致腫瘤復發與轉移［1］。

表2 流式細胞儀檢測小鼠爪墊腫瘤細胞凋亡率（%）

正常的淋巴結基質主要由羥脯氨酸組成，表現為疏水性和無極性，淋巴結內沒有動靜脈，其營養主要依賴淋巴液提供，所以水溶性抗癌藥物難以經由血液系統進入淋巴系統。淋巴系統具有吞噬大分子物質和微粒的特性，微粒在淋巴結的竇間隙內被攝取或被網狀內皮系統主動吞噬后，一部分停留在淋巴結內，另一部分運行至下一站，到達所引流的各級淋巴結內［2］，在相應區域淋巴結長時間的滯留，這也為抗癌藥物與腫瘤細胞長時間接觸并被殺滅提供了可能。為了提高淋巴系統內抗癌藥物濃度，目前主要是通過微粒載體將抗癌藥物導入淋巴系統內，因此提出淋巴靶向化療的觀點。淋巴靶向化療后，抗癌藥物在淋巴系統內可以形成高濃度持續給藥，既可有效殺傷腫瘤細胞，又可減少進入血液循環的藥物劑量，減輕全身毒副作用［3］。

納米活性炭具有超強的吸附能力和良好的淋巴靶向性［4］，對多種抗癌藥物有高吸附性，其吸附機制主要靠氫鍵、范德華力物理吸附，抗癌藥被吸附后，藥物的理化性質不會發生改變。本實驗所用納米碳（卡納琳），以平均粒徑為150nm的團粒形式存在，納米炭注射到局部組織后不能進入毛細血管［31］，而巨噬細胞對納米炭顆粒的吞噬作用使其能夠進入毛細淋巴管，并到達局部引流淋巴結。進入淋巴結的納米炭緩慢釋放抗癌藥物，使其周圍游離的抗癌藥物始終維持一定的濃度，這種功能緩釋性［5］，也是納米炭最大特點。本研究中與A組相比，B組、C組和D組小鼠腘窩淋巴結黑染，這說明吸附抗癌藥的納米炭可以靶向性進入淋巴系統內，并長時間滯留于淋巴結內，持續發揮殺傷、殺滅腫瘤細胞的作用。

臨床研究表明，氟尿嘧啶和奧沙利鉑都是對結腸癌公認有效的藥物，奧沙利鉑聯合5－FU是常用的結腸癌的一線化療方案［6］。故本實驗選用氟尿嘧啶和奧沙利鉑作為淋巴化療藥物，并設計D組實驗小鼠為納米炭載氟尿嘧啶和納米炭載氟奧沙利鉑聯合用藥組。氟尿嘧啶、奧沙利鉑也是細胞毒性抗癌藥物，單藥不能進行局部注射，溢出血管外可引起組織潰瘍及壞死，但本實驗結果顯示B、C和D組的小鼠爪墊注射部位皮膚無潰瘍和壞死，這可能是因為納米炭吸附抗癌藥后是緩慢釋放藥物，避免了因化療藥物瞬時高濃度產生局部壞死等毒副作用。

抗癌藥物通過誘導腫瘤細胞凋亡是其主要治療作用之一［7］。凋亡檢測方法眾多，原理各異，每種凋亡檢測方法各具特點，但均有一定的局限性。流式細胞術檢測早期凋亡更為靈敏，是目前較為理想的凋亡定量檢測方法。腘窩淋巴結腫瘤細胞主要在邊緣竇，如果分離時間不夠，則細胞數量較少，如果分離時間較長，則先分離下來的細胞膜的完整性易受破壞，造成假陽性結果。因為分離到足夠數量級腫瘤細胞的難度較大，所以不適宜用流式細胞儀檢測其凋亡情況。原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記法（TUNEL）在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用［8］，此法能快速準確地反映細胞凋亡形態特征、染色定位及其在組織中的分布，因而本實驗腘窩淋巴結轉移癌細胞凋亡情況選用TUNEL法檢測。實驗結果顯示：在小鼠淋巴結轉移癌細胞凋亡指數和小鼠爪墊腫瘤細胞凋亡率方面，B、C、D各組與A組相比，有顯著統計學意義，D組分別與B組、C組相比，差異顯著，這也證實了奧沙利鉑與氟尿嘧啶聯合使用具有協同抗癌作用［9］。

實驗結果表明，應用載藥納米炭對小鼠結腸癌轉移模型進行淋巴化療，能夠誘導種植腫瘤和淋巴結轉移癌細胞的凋亡，納米炭載氟尿嘧啶和奧沙利鉑聯合用藥有協同增效誘導腫瘤細胞凋亡的作用。

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