在HER2過表達乳腺癌細胞中曲妥珠單抗抵抗的分子機制

萬廣穩，張 研，劉 斌，劉晶晶，徐廣甍，喬士興

（吉林大學第二醫院，吉林 長春130041）

乳腺癌是嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一，隨著環境、飲食及生活習慣等的改變，我國乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢。研究結果顯示在25%－30%的乳腺癌中存在HER－2基因異常擴增及其蛋白的過度表達［1，2］。HER－2陽性的乳腺癌患者惡性程度高，預后差，該指標已成為評價乳腺癌預后的重要指標。

目前靶向HER－2進行基因治療方法有多種，如RNA干擾（RNAi）、反義寡核苷酸、抗HER－2疫苗、酪氨酸激酶抑制劑、細胞內單鏈抗體等，其中應用臨床并證明有效的藥物是曲妥珠單抗（TZB），其對HER－2陽性乳腺癌的治療是革命性的成果，即使化療無效的乳腺癌患者應用TZB治療仍部分有效，曲妥珠單抗聯合放化療大大提高了HER－2陽性乳腺癌的有效率，延長了患者的生存時間及減少復發率。目前我們通常根據免疫組化所測定的HER2蛋白表達情況或原位熒光雜交（FISH）所測定的HER2基因擴增情況，來選擇是否采用曲妥珠單抗治療。然而，即使是HER2高表達或基因擴增的患者，曲妥珠單抗有效率也僅為12%－34%，許多患者在接受治療的12個月內出現疾病進展，如何提高曲妥珠單抗的有效率是目前需要解決的問題。近來國外研究表明，自噬具有保護乳腺癌細胞免遭化療、缺氧、代謝應激等導致的細胞死亡作用，本實驗通過RNAi減少微管相關蛋白1輕鏈3－β（LC3）表達來證明是否可以提高TZB對乳腺癌細胞生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 微管相關蛋白（LC3B）一抗為美國Signaling公司產品；羊抗兔及兔抗鼠二抗購自北京中山金橋公司.赫賽汀，美國Genentech公司，儲存在4°C，濃度為21mg／ml。

1.2 細胞培養 乳腺癌細胞株SKBR－3（購自中科院上海細胞庫），200μg／ml TZB誘導維持建立耐TZB的SKBR3細胞，用DMEM培養基（含15%FBS及青霉素與鏈霉素各100U／ml），37℃，5%CO2培養箱中培養，用0.25%胰酶（0.2%EDTA）消化并傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 構建含目的基因的慢病毒載體 在NCBI數據庫中查找LC3的基因序列，按照siRNA設計原則，利用Ambion公司在線設計軟件設計siRNA序列，選出一個核苷酸序列針對LC3干擾靶點，進行Blast基因同源性分析以保證基因沉默的特異性。

①靶序列：（基因序列1043－1061）：

5＇－GCTAGAGAGATCTCCCTAA－3＇

②無義對照目標基因序列：

5＇－GACTTCATAAGGCGCATGC－3＇

用siRNA Hairpin寡核苷酸序列設計軟件設計成雙鏈發夾結構。

將shRNA轉入到慢病毒中（構建含有目的基因的慢病毒載體由上海吉瑪公司協助完成）。

1.4 目的基因轉染TZB抵抗的SKBR3乳腺癌細胞株 第一天：1.靶細胞鋪板24－well加入0.5×105cells／well，0.5ml完全培養液，37℃，5%CO2過夜；第二天：2.稀釋病毒：稀釋液400μl＋終濃度5 μg／ml Polybrene將慢病毒原液40ml加入稀釋液；3.移去細胞培養液，加入Step 2稀釋后的病毒液，同時建立對照，37℃，5%CO2過夜；第三天4.12－24小時移去細胞轉染后的病毒液，加入0.5ml的完全培養液，37℃，5%CO2過夜；第四天：5.依據細胞的形態和類型，加入0.5ml的完全培養液，37℃，5%CO2過夜；第六天：6.通過蛋白電泳及PCR檢測基因的表達及調控。

1.5 實驗分組 以SKBR3乳腺癌細胞及SKBR3－TR細胞為研究對象，來研究LC3表達情況。以SKBR3－TR細胞為研究對象，實驗分三組，一組SKBR3－TR細胞為正常組，一組慢病毒載體介導的RNAi無義基因轉染SKBR3－TR細胞為陰性對照組（SKBR3－TR＋NC）；另外一組為慢病毒載體介導的RNAi LC3轉染SKBR3－TR細胞為實驗組（SKBR3－TR＋LC3Ri）。

1.6 實時定量PCR檢測LC3mRNA的表達 根據Genbank中序列設計特異性擴增引物，目的基因引物序列 MAPLC3B：5′－CCTAGAAGGCGCTTACAGCT－3′，產物長度186bp，內參GAPDH引物序列：5′－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3′，產物長度138bp。收集細胞，用Trizol試劑提取總RNA。取500ng總mRNA反轉錄為cDNA，cDNA 4倍稀釋，利用SYBR染料法在PCR儀上擴增，建立MAPLC3B的標準曲線，溶解曲線及擴增曲線。PCR反應條件：95℃預變性5s；95℃變性5s，60℃退火20s，共45個循環。以陰性對照組為校正樣本，按照ΔΔCt解析法來進行目的基因與管家基因的相對定量。

1.7 Western blot檢測自噬相關蛋白的表達 收集細胞，用1×PBS洗滌3次，每次1 500r／min離心5min，棄上清，加入適量冰預冷的含有PMSF單核細胞裂解液，冰浴30min，12 000r／min離心5 min，取上清移入新Ep管中。蛋白煮沸5min進行變性，分別用10% 和12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣本蛋白，電轉移至硝酸纖維素濾膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，一抗作用4℃過夜，二抗室溫孵育1h，ECL化學發光法顯色，X光膠片顯影，Quantity One軟件進行電泳條帶灰度分析，以相應蛋白條帶的平均灰度值與GAPDH蛋白平均灰度值的比值表示各組蛋白表達水平。

1.8 細胞存活率 細胞種在96孔板，（實驗分組同前，同時加入SKBR3細胞作為對照，每組設3個復孔），種植密度4×103／孔。細胞種植24小時后加入200μg／ml曲妥珠單抗，96小時后檢測細胞活性。應用Cell Counting Kit－8（CCK－8）（DOJINDO公司）試劑盒檢測，96孔板每孔加入100μg的培養液和10μg的CCK8，繼續培養4小時后，用酶標儀450nm處測量吸光度值.

1.9 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，LC3mRNA與蛋白表達水平、細胞存活率均用Mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 實驗結果

2.1 SKBR3組與SKBR3－TR組LC3蛋白表達水平

結果提示耐TZB的SKBR3細胞組較正常組LC3的表達明顯增高，有統計學意義（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測2組細胞中LC3蛋白的表達水平

2.2 不同SKBR3－TR細胞組LC3蛋白水平的變化

實驗組LC3蛋白表達較正常組及陰性對照組明顯降低，實驗組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖2），說明LC3被成功沉默。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測3組細胞中LC3蛋白的表達水平

2.3 實時熒光定量PCR檢測3組細胞中LC3mRNA的表達水平

實時熒光定量PCR結果顯示：實驗組LC3蛋白表達較正常組及陰性對照組明顯降低，實驗組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）（見圖3），正常組與陰性對照組無統計學意義（P＞0.05），在mRNA水平上證實LC3的沉默。

2.4 細胞存活率

CCK－8實驗結果：實驗組LC3被沉默后，細胞存活率較正常組及陰性對照組明顯降低（見圖4），實驗組與對照組有統計學意義（P＜0.05），說明LC3在曲妥珠單抗治療HER2陽性乳腺癌抵抗中發揮著重要的作用，正常組與陰性對照組無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 實時熒光定量PCR檢測3組細胞中LC3mRNA的表達水平

圖4 CCK－8檢測3組細胞存活率

3 討論

自噬性細胞死亡（Autophagic cell death簡稱自噬），屬于Ⅱ型程序性細胞死亡，是除了凋亡以外的另一種程序性死亡方式，是真核細胞所共有的一種通過降解細胞內過多或異常蛋白、細胞器等以維持正常細胞功能的機制，而在細胞無法繼續維持自身生存時誘導細胞主動性死亡［3］。在腫瘤細胞中，自噬有兩方面的生理學功能，一方面，自噬是一種腫瘤抑制基因的機制，另一方面，自噬在腫瘤進展中對抗各種微環境的變化，包括對各種抗癌療法的形成耐受［4］。

有一些腫瘤細胞有較高的自噬活性，自噬可以使腫瘤細胞耐受低營養、缺氧、化療及放療等，從而延長腫瘤細胞壽命，特別在腫瘤進展過程中，腫瘤微環境發生巨大的變化，包括血供不足所造成的營養、生長因子、氧供等不足，腫瘤細胞可以依靠自噬作用將胞內物質降解和循環利用得以繼續存活。自噬缺陷可以使功能紊亂線粒體的聚集，增加有氧應激對細胞膜、蛋白質和DNA的破壞，從而對腫瘤細胞生長產生破壞［5］。在放療誘導乳腺癌細胞凋亡過程中，常會出現腫瘤細胞的輻射耐受現象，從而逃逸凋亡，達不到理想的治療效果。自噬通過去除受損的細胞器，保護腫瘤細胞以對抗抗癌治療比如放療、化療，使腫瘤細胞逃避凋亡［6］，自噬抑制后，可以增加化療的療效［7］。相關研究表明：提高自噬可減輕或者避免凋亡所引起的死亡，而抑制自噬則可有利于腫瘤細胞的凋亡［8］。

RNAi是利用生物體內固有的機制，回避了其它方法帶來的不確定性，特異的抑制基因的表達，其具有特異性、長度依賴性、快速性 、遺傳性、高效性等優點，在研究中已廣泛應用，通過干擾某個基因來特異性的研究該基因的特性，本實驗通過特異性沉默LC3基因來檢測其作用。

曲妥珠單抗是一種人源化的P185胞外區的重組單克隆抗體，最早于1984年Drebin［9］等人提出，于1998年在美國批準上市，它代表了一種對人類疾病的分子靶向藥物的開發成功和令人興奮的模型，它通過將自己附著在HER－2上來阻止人表皮生長因子在HER－2的附著，進而阻斷了乳腺癌細胞的生長，同時還可以刺激自身的免疫細胞來殺死乳腺癌細胞。目前研究表明，HER2陽性乳腺癌單抗耐藥有以下幾種機制：（1）細胞表面蛋白位阻HER2受體導致赫賽汀無法有效與 HER2結合；（2）HER2的下游信號通路上調 HER2下游PI3K／Akt及Ras／MAPK信號通路持續活化；（3）替代信號通路：增加了其他受體的信號。胰島素樣生長因子I型受體（IGF－IR）通路過度活化與赫賽汀耐藥有關；（4）受損的免疫介導機制［10］。本實驗通過實時定量PCR、蛋白免疫印跡檢測LC3mRNA、蛋白的表達證明LC3被沉默，通過CCK－8檢測結果提示耐TBZ的乳腺癌細胞存活率明顯降低，說明LC3在HER2陽性乳腺癌對曲妥珠單抗抵抗過程中發揮重要作用，而LC3是自噬的重要標志，說明自噬在引起TZB抵抗中可能發揮某種重要的調控機制。

目前被證實的可以抑制自噬的臨床相關的藥物相對較少，動物腫瘤模型上的研究表明，自噬抑制劑有如質子泵抑制劑奧美拉唑和順鉑，抗瘧疾藥物氯喹［11］等，隨著研究的深入這些藥物在未來的臨床試驗中可能與曲妥珠單抗聯合，有助于提高曲妥珠單抗對HER2陽性乳腺癌治療的療效.

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