臍帶間充質干細胞的培養及生物學特性

賈芙蓉，何 欣，丁 旭，王 輝，張明明，楊旭紅

（1.解放軍第二〇八醫院，吉林 長春130062；2.吉林省出入境檢驗檢疫局）

間充質干細胞（MSCs）是中胚層發育的早期細胞，為多能干細胞的一種。它最早發現于骨髓中，具有向三種胚層細胞分化的多向分化潛能［1］。近年來，隨著細胞生物技術的發展，干細胞移植已經在臨床開始應用，間充質干細胞成為人們研究的熱點。本實驗從臍帶分離培養出MSC，并對其形態、免疫表型等基本特性進行研究，為干細胞來源和臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α－MEM 培養基（Sigma，USA），PBS（北京博奧森生物技術有限公司），T25培養瓶（NEST），0.1%膠原酶I（Sigma，USA），0.25%胰酶（Sigma，USA），地塞米松 0.1μmol／L、β－甘油磷酸鈉鹽10mmol／L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol／L T75培養瓶（NEST），150mm 培養皿（NEST），二氧化碳培養箱（上海力申科學儀器有限公司），低溫離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司），超凈工作臺（蘇州潔諾凈化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 UC－MSC的原代培養 健康足月胎兒臍帶經產婦同意后，根據倫理委員會通過的指導原則采集，將臍帶用75%酒精沖洗，然后剔除動脈和靜脈，剪碎，成糊狀。用0.1%膠原酶I、雙抗，37℃消化24小時，再加入0.25%胰酶和鹽水，37℃消化1小時，然后加入鹽水混勻，離心，沉淀用α－MEM培養液接種于T25培養瓶中，標記為P0。把培養瓶置于37℃，5%CO2培養箱中培養。用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況，4－6天后換液，棄去非貼壁細胞后，每3天換液一次。

1.2.2 UC－MSC的傳代和純化 原代培養的細胞增殖在瓶底融合基本達到90%時，用0.25%胰酶和鹽水按1∶1混合，消化細胞，用培養液終止消化反應，再用移液管輕輕吹打，使細胞脫壁，然后放入離心管中，1 300r／min，離心5min，棄去上清，收集細胞，加入新的培養液，混勻后傳代。傳于T75培養瓶中繼續培養，標記為P1。用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，每3天換液一次，至貼壁細胞融合達到90%時，消化傳代，按1∶3傳代于150mm培養皿中。之后重復上面操作，反復傳代到P6代。

1.2.3 細胞生長曲線的測定 取生長狀態良好的第3代細胞，消化后，按1×104個細胞／孔接種于24孔板，每隔24小時消化3個孔，收集細胞。用胎盼蘭染色，計數活細胞，繪制生長曲線。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞 將對數生長期培養細胞接種于24孔細胞培養板（1.0×104細胞／孔），非誘導組繼續用完全培養基培養，誘導組培養液中加入標準誘導劑（地塞米松0.1μmol／L、β－甘油磷酸鈉鹽10mmol／L、抗壞血酸磷酸鹽50μmol／L）進行成骨分化誘導，每3天全量換液，第14天應用堿性磷酸酶組化染色試劑盒進行堿性磷酸酶（ALP）染色、應用4－NPP法檢測ALP活性，第21天Von kossa染色。取生長狀態良好的第3代細胞進行檢測，將貼壁細胞常規消化，PE標記CD44，CD73，CD31，CD45，流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 臍帶間充質細胞的形態

倒置顯微鏡下觀察，接種后的UC－MSC呈小圓顆粒，1－3天后開始貼壁，7－10天后，可見貼壁細胞呈紡錘形，多角形，梭形。2周后，增長速度較快，2－3周后可形成片狀融合達到80%－90%，呈現平行排列生長或旋渦狀生長，可以傳代。傳代細胞較原代細胞生長快，連續傳6代，細胞形態無明顯變化。見圖1。

圖1 UC－MSC細胞形態

2.2 生長曲線

傳代后各代細胞生長曲線均呈S型，第1－2天細胞處于潛伏期，無明顯增殖，一般第3天開始增長，第10－12天可達到80%以上融合，然后進入平臺期，見圖2。

圖2 UC－MSC生長曲線

2.3 流式細胞儀檢測UC－MSC表面標志

取第3代臍帶間充質干細胞，用流式細胞儀檢測，CD31陽性率0.1%，CD45陽性率0.2%，CD44陽性率93.5%，CD73陽性率40.0%。見圖3。

2.4 成骨與成脂定向誘導分化與鑒定

成骨分化定向誘導培養后1周，部分細胞基質出現結節樣鈣沉積。培養2周之后，按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作步驟進行堿性磷酸酶染色。染色后，堿性磷酸酶在胞漿內顯示為藍色顆粒狀物，對照組細胞未加誘導劑，堿性磷酸酶染色呈陰性。成脂分化定向誘導培養后1周時，少數細胞內就出現微小明亮的脂滴。隨著誘導時間的延長，出現脂滴的細胞增多，細胞由梭形變成橢圓形或角形。培養2周后，脂滴數目增多、融合。油紅0染色后鏡下觀察，細胞內脂滴呈明亮橙紅色，非誘導組呈陰性。見圖4。

圖3 流式細胞儀檢測UC－MSC

圖4 成骨與成脂定向誘導分化和鑒定

在成骨分化誘導培養3周后，進行Von kossa染色，發現誘導組出現黑色的礦化結節，非誘導組細胞Von kossa染色呈陰性（200×）。見圖5。

3 討論

圖5 Von Kossa染色

間充質干細胞呈纖維狀，是多能干細胞中的一種［2］。它具有高度自我更新能力和多向分化潛能，能在特定條件下分化為神經細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等，已應用于臨床治療急性移植物抗宿主病、缺血性心臟病、缺血性腦病等，安全有效［3］。MSCs在骨髓組織中含量最為豐富，但骨髓取材困難，供者難以接受，來源受到限制，而且隨著年齡的老化，骨髓源MSCs細胞數量及增殖分化潛能顯著下降，并且存在病毒感染的潛在危險。本實驗采用細胞貼壁法分離、培養UC－MSC，細胞形態以梭形類纖維樣為主，傳代后細胞生長較快，流式細胞儀檢測第三代UC－MSC表面抗原，CD31和CD45幾乎無表達，CD44陽性率93.5%，CD73陽性率40.0%，成骨與成脂定向誘導分化，鑒定陽性，說明本實驗方法可得到純度較高的間充質干細胞［4］。

UC－MSC目前已可穩定地在體外分離，并且擴增迅速，已無來源及數量上的限制，而低免疫原性、支持造血及多向分化潛能的特點使其有著廣泛的應用前景，在細胞替代治療及組織工程方面有極大的應用價值，為神經系統疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等的治療帶來了新的希望。

［1］Plttenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchvmal stem cells［J］.Science，1999，284（5411）：143.

［2］Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow ［J］.Nature，2002，418 ：41.

［3］Lee JS，Hong JM，Moon GJ，et al.A long－term follow－up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke［J］.Stem cells，2010，28：1099.

［4］Deans RJ，Mlseley AB.Mesenchymal stem cells：biology and potential clinical uses［J］.Exp Hematol，2000，28（8）：875.