人SPK1基因的重組腺病毒載體感染效率及表達特性研究

楊 陽，馬 嶸，張 遠，劉郁東，汪 敏，孫圣剛，黎 鋼＊

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院 神經內科，湖北 武漢430022；2.華中科技大學同濟醫學院藥理學系，湖北 武漢430030）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種漸進性大腦退行性病變，是最常見的成年癡呆類型，其發病率隨年齡增長逐漸升高。迄今確切的病因與發病機制尚未充分闡明，尚無有效的根治良策。近年來神經鞘脂代謝異常與β淀粉樣蛋白（amyloid beta－protein，Aβ）的神經毒性作用受到諸多研究者的關注［1－3］。神經鞘脂代謝物包括神經酰胺（ceramide，Cer）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）、1－磷酸鞘氨醇（sphingosine 1＿phospate，S1p）等多種代謝產物，目前證明這些代謝產物參與細胞增殖與凋亡的調控。Cer和Sph是細胞增殖的負調控因子，能夠抑制細胞生長促進細胞凋亡；而進一步的代謝產物S1p則刺激細胞生長，抑制細胞凋亡［4］。有人將Cer、Sph和S1p稱為“鞘磷脂變阻器”，SPK是“鞘磷脂變阻器”的關鍵調節因子，SPK將Sph轉化為S1p。國外研究發現，Aβ25－35誘導SH－SY5Y細胞凋亡過程中SPK1活性減低，提示其活性下降參與AD的發病機制，體外高表達SPK1能否減輕Aβ對神經元的損傷值得進一步研究。腺病毒表達載體是目前重要的轉基因病毒載體，可以高效介導基因體內外轉移。鑒此，我們成功構建了Ad－CMV－SPK1，本文主要研究Ad－CMV－EGFP對N2a細胞感染的量效與時程變化，以及Ad－CMV－SPK1在N2a細胞中的表達情況，為進一步研究SPK1的生物學功能提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料攜帶人SPK野生型基因pcDNA3＊SPKWT（FLAG）質粒由軍事醫學科學院放射醫學研究所段海峰老師惠贈；N2a細胞由本實驗室保存；高糖DMEM培養基和OPTI－MEM培養基以及胎牛血清均購自GIBCO公司；Ad－CMV－EGFP和Ad－CMV－SPK1由上海吉凱基因科技有限公司協助構建完成，激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV500，日本）；流式細胞儀（BD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒對N2a細胞的感染效率研究

1.2.1.1 不同感染滴度的重組腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染N2a細胞72h后感染效率。

在96孔板中接種5×103個／孔N2a細胞，待細胞融合率為60%－70%時，分別加入 MOI為0、2.5、5、10、25、50、100的 Ad－CMV－EGFP感染 N2a細胞。72h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達，并以流式細胞儀檢測綠色熒光陽性細胞百分率作為感染效率的判定指標，以確定適宜的MOI。

1.2.1.2 重組腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染 N2a細胞感染效率時程變化 以MOI為25的Ad－CMVEGFP感染N2a細胞后不同時間（24h、48h、72h和96h）收集細胞，經流式細胞儀檢測其感染效率。

1.2.2 重組腺病毒介導的人SPK1基因在N2a細胞中的表達

細胞分為三組：第1組為對照組（未感染病毒組），第2組為感染空病毒組，第3組為感染Ad－CMV－SPK1組。在6孔板接種N2a細胞感染72h后收集各組細胞，用裂解液處理提取蛋白，進行Western blot鑒定。

1.3 統計學方法

數據以±s表示，采用SPSS軟件包進行t檢驗。

2 結果

2.1 重組腺病毒對N2a細胞的感染效率的研究

2.1.1 不同感染滴度的重組腺病毒 Ad－CMVEGFP感染N2a細胞72h感染效率

用不同感染滴度的腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a細胞后72h收集細胞經流式細胞儀定量檢測了其感染效率，并在共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達。重組腺病毒載體對N2a細胞的感染效率在一定范圍內隨著MOI的增加而增高（表1）；MOI為100時共聚焦熒光顯微鏡下幾乎100%的細胞均呈綠色（圖1），流式細胞儀測其感染率高達99.7%（圖2）。MOI為25時感染效率為99.3%（圖3），我們選用MOI＝25為后續實驗的感染滴度。

表1 不同滴度Ad－CMV－EGFP感染N2a細胞72小時感染效率（±s）

表1 不同滴度Ad－CMV－EGFP感染N2a細胞72小時感染效率（±s）

注：n＝3，＊＊與前一組比較P＜0.001，＊＊＊與前一組比較P＜0.0001

MOI（pfu／cell） 細胞綠色熒光蛋白陽性百分率1.0 55.70±0.776 2.5 70.00±3.758＊＊＊5.0 83.90±1.229＊＊＊10.0 94.50±0.954＊＊25.0 98.03±0.721 50.0 99.33±0.175 100.0 99.57±0.133

圖1 重組腺病毒（MOI＝100）感染N2a細胞72h共聚焦顯微鏡觀察

圖2 重組腺病毒（MOI＝100）感染N2a細胞72h流式細胞儀檢測感染率

2.1.2 重組腺病毒 Ad－CMV－EGFP感染 N2a細胞感染效率時程變化 以MOI＝25的Ad－CMVEGFP感染N2a細胞后，于不同時間收集細胞，以流式細胞儀檢測其感染效率（表2）。以MOI＝25的滴度感染N2a細胞24小時感染率為（22.30±0.186）%，48小時感染率為（76.63±1.041）%，72小時達到峰值，96小時有所下降（P＜0.05）。

圖3 重組腺病毒（MOI＝25）感染N2a細胞72h流式細胞儀檢測感染率

表2 重組腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a細胞感染效率的時程變化（±s）

表2 重組腺病毒Ad－CMV－EGFP感染N2a細胞感染效率的時程變化（±s）

注：n＝3，＊代表與前一組比較P＜0.05，＊＊＊代表與前一組比較P＜0.0001

時間（h） 感染效率24 22.30±0.186 48 76.63±1.041＊＊＊72 98.03±0.722＊＊＊96 94.80±0.231＊

2.2 重組腺病毒感染N2a細胞，SPK1蛋白 Western blot鑒定

重組腺病毒感染N2a細胞72h進行Western blot鑒定，結果如圖4所示，感染 Ad－CMV－SPK1組與對照組和空病毒組相比，蛋白表達量顯著增高，因其在約72KD處有融合蛋白（SPK1－EGFP）的表達。

圖4 重組腺病毒感染N2a細胞72h后，SPK1蛋白Western blot檢測

3 討論

SPK是調控細胞生命活動的一個重要代謝酶，目前SPK家族共有8個同工酶被克隆和鑒定，其中SPK1和SPK2源自人類和小鼠［5］。SPK1主要分布在腦、肺、心臟、脾臟和肝臟。SPK2比SPK1多200個氨基酸，主要分布在肝臟和心臟［6］。SPK1的催化產物S1p是一個新發現的同時具有細胞內第二信使和細胞外第一信使雙重功能的脂類生物活性分子［7］。SPK1／S1p在抗細胞凋亡中具有最要地位，其在神經系統變性疾病如AD的地位受到眾多研究者的關注，Gomez［8］2007年發現在 Aβ25－35誘導SH－SY5Y細胞凋亡過程中SPK1活性減低的結果，推測SPK1活性的下降可能參與AD發病機制，并采用脂質體轉染SPK1質粒可以減輕細胞損傷，提示調節其活性將有助于AD的治療。

腺病毒載體因具高感染效率等諸多優點，已成為基因治療領域中最有應用前途的載體系統。本研究通過感染效率實驗確定了適宜的MOI，重組腺病毒載體Ad－CMV－EGFP感染N2a細胞72小時，流式細胞儀和激光共聚焦檢測結果表明 MOI＝100時，感染效率高達（99.57±0.133）%，MOI＝25時感染效率為（98.03±0.721）%，我們選擇 MOI＝25感染N2a細胞，72小時內感染效率隨時間升高，72小時達到峰值，96小時略有下降（P＜0.05）。我們將Ad－CMV－SPK1感染N2a細胞，通過western blot檢測SPK1在N2a細胞有效表達。本研究結果表明：①重組腺病毒載體對N2a細胞具有很高的感染效率。②重組腺病毒載體感染N2a細胞在72－96小時內感染效率較高。③腺病毒載體具有高效轉導基因功能。

本研究確定了攜帶人SPK1基因的重組腺病毒基因在N2a細胞中具較高的感染效率及基因表達特性，為進一步研究SPK1與阿爾茨海默病之間的關系提供了可靠的實驗基礎。

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