慢性乙型肝炎病毒感染者乙肝病毒大蛋白檢測的臨床意義

王建華，王衛國，馬黎麗，王 偉，化術靜，張紅安

（阜陽市人民醫院 檢驗科，安徽 阜陽236004）

乙型肝炎病毒（HBV）是世界上危害公眾健康的最大的感染性因子之一，而我國是乙型肝炎的高發區，人群中乙型肝炎病毒的攜帶率約10.3%左右，慢性乙型肝炎患者約3000萬人［1］。目前臨床對HBV感染患者，通常使用血清學指標（乙肝二對半）、HBV－DNA和肝功能檢測，來反映患者病毒是否復制及抗病毒治療療效觀察。由于e抗原敏感性較差以及HBV－DNA檢測要求較高，臨床需要一種操作簡單易行并且較為敏感的指標來反映病毒復制。HBV－LP是一種包含PreS1、PreS2和HBsAg的病毒包膜蛋白，具有復雜的跨膜構象拓撲結構，參與HBV的吸附、包膜化、組裝、成熟等過程，并與肝細胞纖維化、肝癌及丁型肝炎的發生有關［2－5］。本實驗通過檢測慢性HBV感染者HBV－LP、PreS1Ag、PreS2Ag、HBV－DNA 及肝功能，探討 HBV－LP的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇收集2009年10月至2011年2月于阜陽市人民醫院就診的180例慢性HBV感染者，診斷標準符合第十次全國傳染病與寄生蟲病學會和肝病學分會聯合修訂的病毒性肝炎防治方案，其中 HBV－DNA陽性患者130例，其中男84例，女46例，年齡9～77歲，HBV陰性患者50例，其中男26例，女24例，年齡15～64歲。所有選擇對象留取血清2ml，－80℃凍存備用。

1.2 主要試劑及儀器 乙肝兩對半試劑（上?？迫A生物工程有限公司），HBV－LP、PreS1、PreS2試劑盒（北京熱景生物技術有限公司），HBV－DNA檢測試劑盒（廣州中山達安基因有限公司），肝功能檢測試劑盒和相應標準品及質控品（中生北控生物科技股份有限公司），酶標儀，日立7600生化分析儀等。

1.3 實驗方法 按試劑盒說明書要求ELISA方法檢測二對半、HBV－LP、PreS1、PreS2，按要求設定cut－off值，讀取各孔OD值。HBV－DNA檢測按照說明書要求進行。肝功能檢測按照要求設置測試協議，于生化分析儀檢測。

1.4 統計學方法 采用t或t’檢驗和卡方檢驗。

2 結果

2.1 HBV－LP表達與 HBV－DNA拷貝數的關系180例 HBV感染者，血清 HBV－LP與 HBV－DNA的陽性符合率為94.6%（123／130），陰性符合率為66.0%（33／50），總符合率為86.7%，HBV－LP陽性率（77.8%）與 HBV－DNA 陽性率（72.2%）差異無統計學意義（P＞0.05）。通過分析 HBV－LP各孔吸光度值（OD值）與HBV－DNA拷貝數（取log值）關系，HBV－LP表達與HBV－DNA拷貝數呈正相關（r＝0.53，P＜0.05）

2.2 二對半模式中HBV－LP和HBV－DNA檢測結果 檢出HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性（1，3，5陽性模式）125例，HBV－LP陽性率92.0%（115／125），HBV－DNA陽性率91.9%（75／80），兩者陽性率比較無統計學意義（P＞0.05）。檢出HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性52例（1，4，5陽性模式），HBV－LP陽性率51.9%（27／52），HBV－DNA陽性率42.3%（22／52），兩者陽性率比較無統計學意義（P＞0.05）。其他二對半模式數量較少，暫不統計。

2.3 HBV－LP與Pres1、Pres2表達的關系 180例樣本HBV－LP、PreS1、PreS2陽性率分別為77.8%、58.9%、96.1%，HBV－LP陽性率明顯高于 PreS1（P＜0.01），HBV－LP陽性率低于PreS2（P＜0.01）。

2.4 HBV－LP表達與肝功能指標間的關系 HBV陽性患者的ALT（谷丙轉氨酶）、AST（谷草轉氨酶）水平高于 HBV－LP陰性患者（P均＜0.05），T－BIL（總膽紅素）、TP（總蛋白）、Alb（白蛋白）水平差別無統計學意義（見表1）。

表1 HBV－LP表達與肝功能的結果

3 討論

HBV感染在我國屬于危害較重的傳染性疾病，目前臨床判斷患者病毒是否復制，常用指標是HBeAg和HBV－DNA。臨床發現一部分HBeAg陰性患者，但病毒依然大量復制，而HBV－DNA檢測條件要求高，質量控制嚴格，使其檢測難以廣泛普及。一般抗病毒治療終點選擇是HBeAg和HBVDNA轉陰，但這部分轉陰的患者病情常出現反復。當前需要一種新的指標來反映HBV的復制狀況。HBV的S基因編碼3種外膜蛋白：主蛋白（HB－sAg）、中蛋白（HBsAg和Pre－s2蛋白）、大蛋白（HB－sAg、Pre－s1蛋白和 Pre－s2蛋白，HBV－LP），研究證明HBV－LP在病毒復制過程中起著關鍵作用，可作為受體蛋白與細胞受體結合介導病毒粒子的細胞內攝入，并參與病毒粒子的組裝和分泌，還可以反式激活細胞內病毒的復制等［3，4，6］。

本實驗發現HBV－LP與HBV－DNA有明顯相關性，提示HBV－LP的表達與病毒的復制有關，這為臨床判斷病毒病毒復制與否，提供新的實驗室指標。我們也發現7例樣本HBV－DNA陽性而HBVLP陰性，可能與PCR技術的高靈敏度有關［7］，同時有17例樣本HBV－DNA陰性而HBV－LP陽性，因為HBV感染者血清中有3種顆粒：小球型顆粒、管型顆粒、Dane顆粒，其中管型顆粒和Dane顆粒表面有HBV－LP，這部分患者可能血清中含有管型顆粒而無Dane顆粒，而且HBV－LP在外周血消失需要一定的半衰期，有研究發現抗病毒治療后，HBV－LP的消失比HBV－DNA晚［8］，也有可能雖然血清中檢測不出HBV－DNA，但肝細胞內病毒仍在復制，由于病毒復制時，需要 HBV－LP的合成，使得 HBV－LP較早釋放入血。當前，用于抗HBV的胞苷類藥物主要抑制DNA聚合酶活性，以肝功能改善和HBVDNA轉陰來選擇治療終點，但一部分患者雖然HBV－DNA轉陰，但很快病情出現反彈，這可能與HBV－LP繼續表達，反式激活病毒復制有關。Gripon等研究發現［9］，源于大蛋白的乙?；亩文軌蚴垢渭毎砻娴氖荏w失活，切斷病毒感染其他肝細胞的途徑，這為抗病毒靶點及治療終點的選擇提供新的可能，也提示HBV－LP檢測或許可以檢測抗病毒療效，但這需要更加全面深入的研究。

本實驗分析兩種常見二對半模式HBV患者發現，HBV－LP和 HBV－DNA陽性率無統計學差異，HBeAg陽性患者，HBV－LP和 HBV－DNA陽性率均較高，提示病毒正在復制，但是HBeAg陰性患者，HBV－LP和HBV－DNA都有一定的陽性率。由于迫于機體免疫壓力和藥物壓力等，造成HBV基因組的前C區和核心啟動子變異，HBeAg轉陰，但病毒仍然在復制，以上實驗說明HBV－LP比HBeAg反映病毒復制更加確切和靈敏。同時比較HBV－LP和PreS1、PreS2表達發現，HBV－LP陽性率明顯高于PreS1，而低于PreS2表達。根據HBV外膜蛋白的結構，只有HBV－LP中包括PreS1，造成這種檢測率的差異，主要與選擇單克隆抗體有關，檢測PreS1的抗體是針對其線性表位，PreS1抗原的表位在形成空間構象時，只有一部分關鍵氨基酸序列暴露在外［4］，由此造成PreS1檢出率偏低，而HBV－LP檢測采用的是立體構象表位。本實驗PreS2蛋白檢出率均較高，一般情況下，HBV感染者不會只有小蛋白表達，而且一旦發生PreS2表達缺失，會引起肝細胞嚴重損失，雖然PreS2表達與病毒的復制有關，但本實驗檢測結果顯示其檢測缺少一定的特異性，從而限制其在臨床的應用。通過對所選樣本的肝功能分析發現，HBV－LP陽性患者的ALT、AST水平高于HBV－LP陰性患者，由于ALT及AST是反映肝細胞損傷極為靈敏的指標，提示HBV－LP的表達與肝細胞損傷有關，而其T－BIL（反映肝細胞處理毒素的能力）、TP和Alb（一定程度反映肝細胞合成功能）的差別無統計學意義，主要與肝細胞有強大的代償能力有關。

總之，HBV－LP的表達是病毒復制的指標之一，由于其檢測簡單、快速，在基層醫院有著較好應用前景，是血清學檢測指標的有益補充。

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