富組蛋白1促進(jìn)創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究

富組蛋白是人類腮腺和頜下腺分泌的一組富含組氨酸的陽離子多肽（Histatins），長度為7個(gè)～38個(gè)氨基酸殘基，Hist 1、Hist 3、Hist 5是其中最重要的3種，占富組蛋白總含量的85%～90%，具有廣譜抗菌及抗真菌作用，也被稱為抗菌肽，是口腔局部固有防御系統(tǒng)的重要組成部分[1－3]。Menno等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，富組蛋白家族尤其是 Hist 1和Hist 2對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞具有顯著的促遷移功能，認(rèn)為它是促進(jìn)口腔創(chuàng)面愈合的主要刺激因素；而Histatins只存在于口腔局部系統(tǒng)中，對(duì)人體非口腔上皮創(chuàng)面是否也有此作用，本實(shí)驗(yàn)以表皮細(xì)胞為例，探討富組蛋白對(duì)表皮創(chuàng)面愈合是否有促進(jìn)作用。燒傷病人晚期殘余創(chuàng)面遷延不愈，是目前燒傷治療中比較困難的問題[5]。而創(chuàng)面護(hù)理貫穿燒傷治療的全過程，所以做好創(chuàng)面護(hù)理非常重要。目前，使用較多的方法是濕潤燒傷膏（MEBO）暴露療法，但護(hù)創(chuàng)敷料涂藥厚度厚，藥耗量大，換藥間隔時(shí)間短，并且換藥時(shí)需用1%苯扎溴銨溶液洗凈創(chuàng)面再涂藥[6]。還有臨床常見的糖尿病足、壓瘡潰瘍的護(hù)理，如果在創(chuàng)面護(hù)理中應(yīng)用富組蛋白，既能預(yù)防感染又能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，為創(chuàng)面護(hù)理提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人工合成富組蛋白1，表皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株，1640表皮細(xì)胞培養(yǎng)基，牛血清，0.25%胰酶，PBS緩沖液，倒置顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)箱，普通光學(xué)顯微鏡，電子天平，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用細(xì)胞劃痕法。將長至90%滿的表皮細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，離心，于培養(yǎng)板底部中央做十字形標(biāo)記后，接種表皮細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分 Hist 1實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組、Hist 1＋絲裂霉素實(shí)驗(yàn)組、空白＋絲裂霉素對(duì)照組（絲裂霉素控制細(xì)胞增殖的影響），當(dāng)細(xì)胞單層鋪滿融合時(shí)，用10μL／mL絲裂霉素處理2h后，用無菌200μL移液槍槍頭在培養(yǎng)板底部沿十字形標(biāo)記劃痕建立體外細(xì)胞損傷模型，PBS沖洗劃痕區(qū)殘留細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組各加入250μL含30 μg／mL Hist1、1640低血清（1%牛血清）培養(yǎng)液，對(duì)照組加1640低血清培養(yǎng)液。

在倒置顯微鏡下，每個(gè)劃痕區(qū)利用顯微標(biāo)尺選擇1mm范圍內(nèi)劃痕區(qū)，分別于0h、16h、24h測量，利用image tool軟件計(jì)算愈合面積。

2 結(jié)果

2.1 富組蛋白1對(duì)表皮細(xì)胞創(chuàng)面愈合的影響 與空白對(duì)照組比較，富組蛋白1能明顯促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和遷移，且隨著時(shí)間延長愈合率增加。詳見表1。

表1 兩組表皮細(xì)胞創(chuàng)面愈合率比較（±s） %

表1 兩組表皮細(xì)胞創(chuàng)面愈合率比較（±s） %

組別 16h愈合率 24h 64.60±10.1271.42±8.44空白對(duì)照組 41.23±4.52 48.11±3.94 t值 4.215 5.愈合率Hist 1實(shí)驗(yàn)組004 P＜0.05 ＜0.05

2.2 富組蛋白1對(duì)表皮細(xì)胞遷移能力的影響

2.2.1 Hist1實(shí)驗(yàn)組0h16h24h細(xì)胞遷移情況（見圖1）

2.2.2 空白＋絲裂霉素對(duì)照組0h、16 h、24h細(xì)胞遷移情況（見圖2）

2.3 經(jīng)絲裂霉素處理后兩組表皮細(xì)胞創(chuàng)面愈合率 表皮細(xì)胞經(jīng)過絲裂霉素處理，抑制了其增殖能力，可見富組蛋白1能促進(jìn)表皮細(xì)胞遷移。詳見表2。

表2 經(jīng)絲裂霉素處理后兩組表皮細(xì)胞創(chuàng)面愈合率比較（±s） %

表2 經(jīng)絲裂霉素處理后兩組表皮細(xì)胞創(chuàng)面愈合率比較（±s） %

愈合率Hist 1＋絲裂霉素實(shí)驗(yàn)組組別 16h愈合率 24h 61.97±10.76 67.36±10.39空白＋絲裂霉素對(duì)照組 32.25±2.98 37.65±4.69 t值 5.32 5.21 P＜0.05 ＜0.05

3 討論

3.1 富組蛋白1能促進(jìn)非口腔上皮創(chuàng)面愈合，耗藥量少，換藥間隔時(shí)間長 由圖1可以看出，富組蛋白能明顯促進(jìn)表皮細(xì)胞即非口腔黏膜上皮遷移，為皮膚創(chuàng)面護(hù)理提供了新的途徑?，F(xiàn)在常用的MEBO暴露療法，涂藥厚度要求0.5 mm～1.0mm，換藥間隔時(shí)間要求6h～8 h，換藥同時(shí)還要常規(guī)對(duì)創(chuàng)面周圍用0.1%苯扎溴銨或75%乙醇消毒，避免交叉感染[7]。而30μg／mL的 Hist1在唾液的生理濃度中就能發(fā)揮創(chuàng)面愈合作用。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，16h表皮細(xì)胞遷移活性比8h明顯增強(qiáng)，創(chuàng)面愈合率高。圖1、圖2顯示，24h愈合率與16h相比變化不大，因?yàn)?6h～24h期間沒換藥，實(shí)驗(yàn)證明如果16h后換藥，24h愈合率可以達(dá)到100%。由絲裂霉素處理后空白組0h、16h、24h細(xì)胞遷移情況看出未加Hist1的表皮細(xì)胞遷移緩慢，24h細(xì)胞愈合率只有37.65%，但以什么樣的形式（粉末、液體、噴霧）用作創(chuàng)面敷料及換藥方法還需下一步臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 富組蛋白1用于創(chuàng)面護(hù)理，既能提高創(chuàng)面愈合率，又能節(jié)約護(hù)理成本，減輕護(hù)理人員勞動(dòng)強(qiáng)度 富組蛋白一直作為抗菌肽被人們熟識(shí)，既能對(duì)抗普通細(xì)菌又能對(duì)抗真菌、衣原體等，具有廣譜抗菌作用，現(xiàn)在看來它既能抗感染又能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，因?yàn)镠istins的參與，同樣的傷口，口腔黏膜上皮愈合只需7d，而皮膚卻要幾個(gè)星期[8，9]。早期創(chuàng)面處理的好壞是創(chuàng)面治療成敗的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)從表皮細(xì)胞劃痕即制造創(chuàng)面之初就加入Hist1干預(yù)，燒傷、創(chuàng)傷創(chuàng)面早期有炎性滲出，糖尿病足、壓瘡早期有表皮破損，如不及時(shí)干預(yù)將加大護(hù)理難度和人力物力成本，尤其是長期臥床或保持功能體位者，此時(shí)，只需及時(shí)用藥和理療，即可減少毒性物質(zhì)的吸收，抵抗感染，維護(hù)創(chuàng)面清潔環(huán)境，促進(jìn)愈合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大約1.4mm2的創(chuàng)面16h愈合率為64.60%，24h愈合率為71.42%，如果期間換藥愈合率還可以增加。尤其是較深創(chuàng)面如壓瘡的潰瘍期、糖尿病足晚期、深度燒傷很容易導(dǎo)致真菌感染，而抗真菌藥又有較強(qiáng)的副反應(yīng)，再加上抗生素的大量應(yīng)用，耐藥菌株多[10]。富組蛋白耐藥性小，抗感染能力強(qiáng)，量加大也沒有毒性反應(yīng)[4]。在創(chuàng)面愈合后期，Hist1能促進(jìn)表皮細(xì)胞向創(chuàng)面中央?yún)^(qū)域遷移促進(jìn)表皮愈合，從表2可看出，1.4mm2的創(chuàng)面16h愈合率達(dá)到61.97%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組。所以，富組蛋白在創(chuàng)面早期和晚期都能發(fā)揮較強(qiáng)的促愈合作用，能節(jié)約護(hù)理成本，減輕護(hù)理人員勞動(dòng)強(qiáng)度。今后還需與MEBO暴露療法等常用的創(chuàng)面護(hù)理方法作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，確定優(yōu)劣性和可操作性。

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