IBDV感染對SPF雞腔上囊與外周血單核細胞TLR3／4／15 mRNA表達的影響

郭新風，王麗瓊，李煥榮，阮文科，崔德鳳，王 寧，劉鳳華

［北京農學院動物科學技術學院，北京市獸醫學（中醫藥）重點實驗室，CAU－BUA TCVM教學與科研團隊，北京 昌平102206］

宿主細胞的 Toll樣受體（Toll－like receptors，TLR）通過識別病原微生物保守的分子相關模式，誘導天然免疫信號而激活炎性細胞因子，上調共刺激因子而激活細胞免疫，發揮抗病毒反應［1］。TLR3能誘導干擾素Ⅰ型的釋放；TLR4可介導炎癥反應；TLR15在病毒感染中有報道，可能在機體先天性免疫中發揮作用［2－3］。

雞傳染性腔上囊病毒（IBDV）主要侵害腔上囊內具有IgM的B淋巴細胞，引起嚴重而長期的免疫抑制，導致免疫失敗，影響多種病毒疫苗的免疫應答［4］。IBDV感染可啟動機體先天性免疫，通過巨噬細胞釋放各種細胞因子抵抗病毒感染［5］；通過增強T淋巴細胞功能啟動獲得性免疫［6］。腔上囊單核細胞（BBMC）和外周血單核細胞（PBMC）作為機體重要的免疫細胞，其表面的模式識別受體在IBDV入侵中的識別作用及啟動免疫反應的機理少有報道。本試驗使用相對熒光定量PCR技術，通過分析IBDV感染對SPF雞BBMC和PBMC在感染后不同階段TLR3／4／15mRNA表達的影響，探討IBDV感染對固有免疫反應的影響，為進一步研究IBDV發生過程中宿主與病原相互間的關系奠定基礎。

1 材料

4周齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司；雞傳染性腔上囊病毒（IBDV）BC6／86毒株，購自中國獸醫藥品監察所；Trizol，購自In－vitrogen（美國）公司；淋巴細胞分離液，購自TBD公司。

2 方法

2.1 動物分組及攻毒 4周齡SPF雞30只，對照組和攻毒組各15只，再隨機分為3組，每組5只。點眼途徑感染IBDV BC6／85株標準強毒，50倍的囊最小感染量（BID）／只雞，對照組給予相同劑量的生理鹽水。

2.2 腔上囊和外周血單核細胞的制備 分別在感染后1、5、15d采集雞心臟EDTA抗凝血，按照雞淋巴細胞分離液說明書介紹的步驟進行雞外周血單個核細胞（PBMC）分離，臺盼藍計數，配成1×106個／mL濃度的懸浮液，－80℃貯存備用；無菌取腔上囊，去除表面的脂肪組織、被膜等，2%犢牛血清的1640沖洗，刀背刮取腔上囊內淋巴細胞于2%1640培養基中，分別進行150目篩和300目篩過濾離心，同PBMC步驟分離雞腔上囊單個核細胞，臺盼藍計數，配成1×106個／mL濃度的懸浮液，－80℃貯存備用。

2.3 引物的合成與RNA的反轉錄 根據Gen－Bank上各基因的序列，用Primer 5.0在保守區設計各自的特異PCR引物（表1）。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

表1 β－actin、TLR3、TLR4與TLR15擴增引物的序列和反應條件

按照Trizol說明書提取細胞總RNA。反轉錄在20μL體系中進行，1μL總RNA，DEPC水11 μL，Oligo（dT）0.5μL，70℃5min，M－MLV RT 5×Buffer 4μL，dNTP 2μL，MgCl21μL ，Ribo－nucelase Inhibitor 0.5μL，42℃ 60min，70℃15 min。反轉錄產物置－80℃冰箱備用。

2.4 SYBR GreenⅠ相對熒光定量RT－PCR檢測方法的建立 本試驗選用β－actin作為參照基因［7］。將β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的陽性cDNA進行10系列稀釋成6個梯度作為模板，利用各自的特異性引物進行real－time PCR建立各自的標準曲線。20μL PCR反應體系：10μL SYBR Green Real－time PCR Mix，1μL Rox Buffer，0.6μL上游引物，0.6μL下游引物，模板1μL，加水至20μL 。PCR反應程序為：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，共40個循環。根據熒光值的變化，系統自動生成標準曲線。擴增效率基本一致時方可采用相對熒光定量比較CT值［8］。

2.5 統計分析 應用SPSS13.0對數據進行方差分析，P≤0.05表示差異顯著。使用2△△Ct法對感染后不同時間的toll樣受體分子進行比對。

△△Ct＝（Ct目的基因－Ct看家基因）×試驗組－（Ct目的基因－Ct看家基因）×對照組

2－△△Ct表示的是試驗組目的基因表達對于對照組的變化倍數。

3 結果與分析

3.1 β－actin、TLR3、TLR4 和 TLR15 熒光定量PCR標準曲線的建立 以10倍系列稀釋的β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的陽性cDNA標準品為模板進行real－time PCR，得到檢測用 β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的熒光定量PCR溶解曲線（圖1）和標準曲線方程：

Y＝－4.017＊log（x）＋0.67，R2＝0.998；Y＝－4.128＊log（x）＋6.33，R2＝0.996；Y＝－4.097＊log（x）＋14.31，R2＝0.991；Y＝－4.089＊log（x）＋9.33，R2＝0.997

圖1 TLR3、TLR4、TLR15及 β－actin基因的SYBR Green I rea－l time PCR 溶解曲線

溶解曲線表明，擴增產物形成單一的特異性溶解峰，其Tm值介于82.6℃～87.6℃之間。標準曲線方程表明，標準品起始模板濃度與Ct值呈現良好的線性關系，相關系數r2均達到0.991以上，且TLR3、TLR4和TLR15與β－actin曲線斜率值相差小于0.1，可用于β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的mRNA水平相對定量分析。

3.2 TLR3、TLR4和TLR15相對熒光定量結果分析 如圖2所示。與對照組相比，BBMC中TLR3的mRNA表達水平在IBDV感染后1d和感染后5 d均上調，差異顯著（P≤0.05），PBMC中僅在感染后1d顯著上調；感染后15dBBMC中TLR3恢復到正常水平，而PBMC中TLR3表達仍極顯著高于對照組（P≤0.01）。

差異顯著（P≤0.05），PBMC中 TLR4的 mRNA表達水平在感染后始終高于對照組，且在感染后15d極顯著高于對照組（P≤0.01）。BBMC中TLR15的mRNA表達水平在感染后1d顯著高于對照組（P≤0.05），感染后5d和15d無顯著差異；而PBMC中TLR15mRNA表達水平在感染后1d極顯著高于對照組（P≤0.01），在感染后5d和15d未檢測到。

圖2 感染后不同時間BBMC和PBMC中TLR3／4／15mRNA水平

4 討論

Toll樣受體是固有免疫中重要的識別受體，在機體識別各種病原微生物方面起著重要的作用。檢測Toll樣受體在感染初期（1dpi）、急性感染期（5dpi）與恢復期（15dpi）的 mRNA 表達水平變化，可探討IBDV感染對機體免疫反應的影響。本試驗應用實時熒光定量PCR方法，構建了內參基因β－actin及TLR3、TLR4、TLR15的標準曲線，利用內參基因β－actin消除mRNA的提取效率和反轉錄效率間的差異，結果可信度高，為檢測雞TLR3、TLR4、TLR15的表達水平提供了方法。

TLR3主要識別雙鏈RNA分子，在人類類風濕性關節炎等自身性免疫性疾病中的表達上調［9］。劉爵等應用間接免疫熒光和免疫印記技術驗證在TLR3基因沉默的細胞里，病毒VP2蛋白表達量下降，細胞中病毒滴度下降［10］，表明 TLR3在IBDV感染過程中起重要作用。本試驗中，BBMC和PBMC中TLR3mRNA表達水平在不同的時間段均表達上調，且差異顯著，推測TLR3可能在機體識別病毒中起作用。TLR4存在于多種細胞中，主要識別細菌的脂多糖，近年來有哺乳動物在病毒感染中TLR4表達量變化的報道［11］，證明TLR4在病毒的免疫防御中有重要作用，推測TLR4在禽類病毒感染中可能有相似的作用。本試驗中，BBMC和PBMC中，TLR4mRNA表達在急性感染期及恢復期均顯著上調，提示TLR4參與了IBDV感染過程中機體免疫系統的激活，IBDV感染后引起的腔上囊急性損傷可能與TLR4介導的炎性反應有關。TLR15是禽類特有的Toll樣受體，有報道雞感染馬立克等病毒后也導致TLR15表達上調［12］。本試驗顯示，BBMC和PBMC中TLR15的mRNA表達水平在感染后1d均顯著高于對照組，表明TLR15在感染初期識別IBDV感染中起到重要作用。此后，TLR15在BBMC中恢復至正常水平，而在PBMC中未檢測到，提示IBDV感染后期PBMC中TLR15mRNA表達受到抑制。最近有報道，球蟲感染的雞腸道TLRs的表達下調可能導致雞腸道免疫功能紊亂，增加機體對其他疾病的易感性［13］，推測TLR15在IBDV感染中有相似的作用。

綜合分析表明，IBDV感染后雞腔上囊單個核細胞和外周血淋巴細胞中TLR3、4、15mRNA表達均有不同程度的上調，提示IBDV感染早期激活了機體的固有免疫反應，發揮抗病毒作用，其識別病毒的機理及在免疫應答中的作用有待于進一步研究。

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