羊腸毒血癥的病原分離及PCR診斷

李生慶，張西云，李志寧，范玉霞，胡國元，黃 榮，王亭亭，李積良

（1.青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧810016；2.青海省祁連縣央隆鄉獸醫站，青海 祁連810400）

羊腸毒血癥是由D型產氣莢膜梭菌感染并在羊腸道中大量繁殖產生毒素所引起的一種急性毒血癥。病羊死后腎組織易于軟化，因此，該病又稱“軟腎病”。因該病發病急，死亡突然，且死亡率高，不易治療，常常給養羊戶帶來較大的經濟損失。

由于引起該病的病原菌為土壤常在菌，芽孢隨飼料和飲水被羊食入，可長期存在于腸道中，當消化道機能受到損壞時，病原菌迅速繁殖并產生大量毒素，從而使羊發病死亡，因此，很難在胃腸道之外的其他臟器內分離到病原菌，這給該病的診斷工作增加了難度。鑒于此，根據D型產氣莢膜梭菌所產的α、ε兩種毒素設計具有特異性的擴增引物，進行PCR診斷可在很大程度上降低診斷的難度，并可節省時間，提高疫病診斷的精確性。

1 材料

1.1 病料來源 采集的病料為2009年9月青海省祁連縣發生急性死亡的羊只臟器。

1.2 標準菌株 產氣莢膜梭菌標準菌株C60－2，購自中國獸醫藥品監察所微生物室；腐敗梭菌FB2010、乳酸大腸桿菌株（XR84）、金黃色葡萄球菌（JP86）為我室分離保存菌株。

1.3 培養基的制備 血液瓊脂、厭氣肝湯兩種培養基均按常規制備，121℃滅菌40min，4℃保存備用。

1.4 試劑TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTP（10mmol／L）、25mmol／L的 MgCl，均購自北京博邁德科技發展有限公司；瓊脂糖為Biowest產品；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5 試驗動物 18～22g昆明系小鼠，購自青海省地方病研究所。

2 方法

2.1 病原分離 取病死羊腸道逐段抹片鏡檢，接種疑似菌密度較大腸段的內容物于加有新鮮生肝塊的厭氧肉肝湯37℃培養24h，將該培養物接種于鮮血瓊脂平板上，挑取疑似菌落，以得到疑似菌株的純培養物；也可直接用腸內容物劃線接種于鮮血瓊脂平板，挑取疑似菌落。

2.2 動物試驗

2.2.1 腸內容物毒素測定 將病死羊的回腸內容物1mL加入9mL生理鹽水中，充分混勻后5 000 r／min離心30min，吸取上清液，用生理鹽水作適當稀釋后，在可能的毒力范圍內靜脈注射小鼠，每一滴度注射2只，0.2mL／只，觀察記錄小鼠發病、死亡情況，確定小鼠最小致死量。

2.2.2 分離菌株毒素測定 取該菌的純培養物，5 000r／min離心30min，吸取上清1mL加含2.5 g／L胰酶的10g／L的碳酸鈉溶液1mL，37℃活化30min后，用生理鹽水倍比稀釋，每一滴度靜脈注射小鼠2只，0.2mL／只，觀察記錄小鼠發病、死亡情況，確定小鼠最小致死量。

2.3 D型產氣莢膜梭菌的PCR檢測

2.3.1 DNA模板的制備 將純化的分離待檢菌和標準陽性產氣莢膜梭菌分別接入厭氧肉肝湯中，37℃培養24h，取1.5mL培養液于離心管中12 000r／min離心1min，棄去上清液，用1×PBS 200 μL懸浮菌體，13 000r／min離心1min，棄上清后加入200μL1×PBS重懸，混勻后加入蛋白酶K 20 μL，再加200μL CB結合液，混勻后，70℃水浴放置10min.取出冷卻后加100μL異丙醇，混勻。利用北京博邁德生物科技發展有限公司研制的組織／細胞DNA提取試劑盒提取DNA.提取物于4℃冰箱保存備用。

2.3.2 引物設計 根據GenBank中報道的產氣莢膜梭菌基因序列及相關的參考文獻［1－4］，分別在α毒素和ε毒素的保守區域設計2對引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列如下：

α毒素：上游引物：5′－CACGATGTATCAGAGGGTA－3；下游引物：5′－TAAGTGTCTTTGCTTCCAG－3′

預期擴增片段大小：202bp

ε毒素：上游引物：5′－GTATCTAATGAAATGTCCA－3′；下游引物：5′－CTTCCACTTACTTGTCCTAC－3′

預期擴增片段大小：585bp

2.3.3 PCR擴增反應體系 PCR反應總體系為25μL：10×Buffer緩沖液 2.5μL，10mmol／L dNTP 1.0μL，上下游引物各0.5μL，模板 DNA 5.0μL，TaqDNA 聚合酶0.5μL，滅菌雙蒸水14 μL。

反應程序為：96℃預變性20min，然后94℃變性30s，51℃延伸40s，72℃復性1min，共循環30次，最后在72℃延伸10min。

2.3.4 PCR產物電泳 PCR反應結束后取5μL產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳60V，65min，紫外燈下觀察并拍照，分析PCR擴增結果。

2.4.5 PCR檢測的特異性試驗 分別以乳酸大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗梭菌等作陰性對照，檢測PCR反應的特異性。

3 結果

3.1 分離菌的形態與培養特性 小腸內容物涂片、革蘭染色鏡檢，可見大量革蘭陽性兩端鈍圓大桿菌，單個散在或成對存在。在厭氧肉肝湯培養24h后涂片見到與小腸內容物涂片相同的細菌；在鮮血瓊脂平板上厭氧培養，24h開始生長，48h可見圓形略隆起、灰白色半透明的菌落，菌落周圍有溶血環，涂片鏡檢可見與腸內容物涂片相同的細菌。

3.2 動物試驗結果 腸內容物離心上清注射小鼠后可見興奮、轉圈、翻滾等癥狀，分別于4～22min內死亡。測得其小鼠最小致死量為200～400 MLD／mL；分離菌培養物的最小致死量為200～1 600MLD／mL。

3.4 PCR擴增結果 利用合成的2種引物進行PCR擴增，標準菌株C 602和分離菌株都擴增出大小為202bp的α毒素及585bp的ε毒素的目的條帶，結果如圖1。

圖1 產氣莢膜梭菌分離株PCR擴增圖

3.5 特異性試驗 在相同條件下，只有標準菌株和兩株分離菌擴增出大小202bp的α毒素及585bp的ε毒素相應條帶，其他腐敗梭菌、乳酸大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均未擴增出上述條帶，表明試驗結果具有好的特異性。結果如圖2。

圖2 特異性擴增結果

4 討論

長期以來，主要采用動物毒素中和試驗來鑒別產氣莢膜梭菌的菌型，操作起來比較繁瑣，而且有諸多不定的影響因素，容易造成誤差。本試驗采用的PCR方法則可直接檢測毒素的基因，從而不依賴于該菌是否產生了腸毒素。結果表明，PCR診斷方法快速、準確，提高了檢測的準確率和敏感性，加強了時效性，取得了良好的診斷效果。為疾病的快速診斷，流行病學調查提供了科學依據，為建立多重PCR診斷方法奠定了基礎。

［1］龔玉梅，Pat Blackall，陳卓明，等.產氣夾膜梭菌型特異性多重PCR 的研究［J］.中國獸藥雜志，2004，38（2）：22－25.

［2］文其乙，劉秀梵.多重PCR方法快速檢測糞樣中產氣夾膜梭菌［J］.中國預防獸醫學報，2002，24（1）：48－51.

［3］Augustynowicz E，Gzyl A，Slusarczyk J.Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens with a duplex PCR［J］.Diagnostic Microbiology.2002：169－172.