熱應激對小鼠睪丸組織的影響

郭洪香 蔣靜思 劉 波 袁安文，2*

（1.湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128；2.長沙綠葉生物科技有限公司，長沙 410125）

對于大多數哺乳動物來說，陰囊內睪丸的溫度比體溫低2～8℃，保證睪丸曲細精管內的精子發生正常進行。如果環境溫度升高至一定程度，睪丸溫度會隨體溫升高而超出最適溫度范圍，不利于精子形成[1]。睪丸溫度升高到38℃以上，會引起生殖上皮細胞變性，生精小管中的精子受到影響[2]。熱應激能夠導致睪丸組織嚴重損傷[3]。溫度成為影響動物繁殖性狀的重要因素之一。雖然研究不同溫度影響雄性睪丸已有報道，但從不同溫度和不同時間2個因素探索熱應激對睪丸組織影響的研究卻很少。為此，我們以昆明小鼠為試驗動物，應用小鼠睪丸熱應激模型，觀察睪丸形態學變化規律。以探索不同時間不同溫度小鼠睪丸組織的耐受性，找到有害溫度及時間的極限，為進一步研究熱應激對雄性動物生殖機能的影響，改善環境溫度和飼養管理條件，加強營養調控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：本實驗選用8～9周雄性昆明小鼠，要求其臨床健康，自由飲食，飼養環境溫度10～20℃。

主要儀器與試劑：0.5%戊巴比妥鈉、10%福爾馬林、HE染液；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司 DK-S24）、電熱恒溫培養箱（南京實驗儀器廠 HG303-3K）、體式顯微鏡（Motic SMZ-168）、生物顯微鏡（ZEISS Primo Star）、顯微攝像系統（MOTICAM 2306）、電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司 AE100S）、電子天平（長沙湘平科技發展有限公司 ES-5-HA）、切片機（ROTARY MICROTOME Reichert Histo STAT）

1.2 方法

實驗分為3個大組，40℃熱處理組18只，（分為3個小組，各6只，分別放入40℃水中，水浴0.5 h，1 h以及1.5 h）；41℃熱處理組18只（分為3個小組，各6只，分別放入41℃水中，水浴0.5 h，1 h以及1.5 h）。對照組6只，進行全身麻醉，不進行熱應激處理。用電子天平對實驗雄鼠稱重，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉0.5～0.8 ml對小鼠進行麻醉。參照Paul等[4]的方法將麻醉的小鼠后1/3（后肢、尾和陰囊）浸入設定溫度的電熱恒溫水浴鍋水中30 min，對小鼠睪丸進行熱應激處理。于熱處理后第7 d處死小鼠，處死前稱量體重。采集睪丸并稱重，睪丸放入中性福爾馬林液中固定，用于組織切片觀察。

1.2.1 睪丸系數的測定

參照肖漢洪等[5]的方法測定睪丸系數。睪丸系數=（睪丸重/體重）×100%；

1.2.2 睪丸組織石蠟切片的制作與觀察

將采集的小鼠睪丸在10%福爾馬林浸泡固定，24 h以后的組織用自來水浸泡沖洗，過夜。按照常規石蠟制作過程脫水、透明、浸蠟、包埋，切片（厚度4 μm）、HE染色；封片。用生物顯微鏡觀察睪丸組織切片中曲細精管、生殖細胞的形態變化情況，并用顯微攝像系統進行顯微照相。

1.3 數據分析

實驗數據用EXCEL軟件進行統計處理，實驗結果以“平均數±標準差”表示，用SAS9.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 熱應激對小鼠睪丸的影響

不同溫度不同時間熱處理后小鼠睪丸系數的變化情況見表1。相同溫度水浴處理時間不同，熱應激對小鼠睪丸損傷情況不同。與對照組相比，40℃水浴處理0.5 h組睪丸指數變化不顯著，1 h組睪丸指數變化顯著，1.5 h組睪丸指數變化極顯著；40℃水浴處理組間，與0.5 h組比較，1 h組睪丸系數差異顯著，1.5 h組睪丸系數變化極顯著；1 h組與1.5 h組比較，差異極顯著。與對照組相比，41℃水浴處理組睪丸指數變化均為極顯著；組間比較差異不顯著。

表1 不同溫度不同時間水浴處理對小鼠睪丸系數的影響

同一列數字右側不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）；不同小寫字母表示差異顯著，（0.01＜P＜0.05）

2.2 睪丸組織形態觀察

不同溫度不同時間熱處理后小鼠睪丸組織形態。對照組（圖1G）生精小管內各級生精細胞排列緊密，整齊有序，結構清晰完整，細胞層數多，可見各個發育階段的精原細胞、精母細胞、精細胞。與對照組比較，40℃0.5h水浴處理組（圖1A）沒有明顯變化。40℃1h水浴處理組（圖1B），細胞排列疏松無規則，細胞層數減少，精細胞和精母細胞減少。40℃1.5h水浴處理組（圖1C），生精細胞層數和數量減少，未見成熟精子，生精小管內出現空泡化；41℃0.5h水浴處理組（圖1D），細胞排列紊亂，有多核巨細胞存在；41℃1h水浴處理組（圖1E），細胞層數和細胞數量明顯減少，小管腔少見或未見精細胞，有多核巨細胞存在；41℃1.5h水浴處理組（圖1F），生精細胞顯著減少，有些生精小管成為空腔。

3 討論

3.1 關于小鼠睪丸系數的變化

相同時間不同溫度或相同溫度不同時間處理組的小鼠睪丸系數差異顯著。40℃0.5 h熱應激組與對照組比較，小鼠睪丸系數變化不明顯。1 h組睪丸系數變化顯著，1.5 h組睪丸系數變化極顯著；與對照組相比，41℃水浴處理組睪丸系數變化均極顯著。雄性動物陰囊組織結構與睪丸血管的逆熱流交換機制，使睪丸溫度低于體溫，成為精子發生的重要保證[6]。如果環境溫度超過小鼠自身調節溫度，睪丸局部受熱，陰囊的調節機制受到影響，引起睪丸組織缺氧，產生熱應激反應。初期機體大量出汗導致機體和含水量較多的器官如睪丸失水，睪丸質量也會減輕。另外，熱應激導致睪丸生精小管內細胞減少，出現空泡化，也會導致睪丸質量減輕。水浴處理對采樣小鼠體重影響不大，所以睪丸系數下降。隨著熱應激時間的延長，小鼠睪丸重量下降，這與李德軍[7]等研究結果相吻合。

3.2 關于小鼠睪丸損傷情況

相同溫度不同時間組的小鼠睪丸損傷嚴重，曲細精管內生殖細胞缺失，睪丸內生殖細胞變性凋亡。這與叢霞研究結果相吻合[8]。40℃0.5 h熱應激組與對照組比較，睪丸形態沒有明顯區別。Bank 等研究發現熱應激會導致生殖細胞DNA損傷，進而誘發生殖細胞發生凋亡[9]。41℃水浴處理組中，細胞排列紊亂，細胞層數減少，生精上皮空泡化，出現多核巨細胞，有些生精小管成為空腔。與Chaki 的研究結果相吻合。熱應激引起生精細胞凋亡，尤其是精原細胞和精子細胞，這與Yin，Y研究一致[10]。小鼠體表面積相對比較大，汗腺不發達，通過呼吸散熱和代謝率下降以及耳血管擴張加快散熱。陰囊組織結構與睪丸血管的逆熱流交換機制，可以散熱，相對較低的溫度水浴處理，對小鼠睪丸組織的影響不是很大。睪丸局部溫度升高，生殖細胞新陳代謝加快，氧氣量不足，引起細胞周期紊亂甚至細胞凋亡[4]。水浴處理溫度越高時間延長，睪丸損傷越嚴重。

本實驗中發現，熱應激導致睪丸質量下降，生精細胞凋亡，影響精細胞的生成。本實驗結果表明，相同溫度水浴處理時間越長或者相同時間水浴處理溫度越高，小鼠睪丸系數變化越顯著，睪丸損傷越嚴重。

[1]梁明振，黃桂花，何烽杰，et al.熱應激對公兔精液品質、睪丸組織形態及抗氧化指標的影響[J].廣西農業科學，2010，41（3）：263-265

[2]姜忠玲.熱應激對小鼠附睪內精子的形態學影響[J].黑龍江動物繁殖，2009，17（1）：2-4

[3]田允波.熱應激與奶牛繁殖機能[J].中國奶牛，1992（2）：22-25

[4]Paul，C.，A.A.Murray，N.Spears，et al.A single，mild，transient scrotal heat stress causes DNA damage，subfertility and impairs formation of blastocysts in mice[J].Reproduction，2008，136（1）：73-84

[5]肖漢洪，何耀明.熱應激對小鼠精子發生及其性能的影響[J].湖北農業科學，2002（5）：134-136

[6]趙春生，呂文發，王恒，等.溫度對小鼠睪丸生精機能的影響[J].吉林農業大學學報，2002，24（6）：78-81

[7]李德軍，田文儒，劉運楓，等.熱應激對鼠精液質量影響的研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2010（5）：101-102

[8]叢霞，姜忠玲.熱應激對雄鼠生殖器官及精子發生的影響[J].黑龍江動物繁殖，2007，15（3）：4-6

[9]Banks，S.，S.A.King，D.S.Irvine，et al.Impact of a mild scrotal heat stress on DNA integrity in murine spermatozoa[J].Reproduction，2005，129（4）：505-14

[10]Yin，Y.，K.L.Hawkins，W.C.DeWolf，et al.Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice[J].J Androl，1997，18（2）：159-65